鎳鈦合金裸支架對內皮細胞低密度脂蛋白穿胞影響的初步研究

陶然 熊斌 鄭傳勝 梁明 王奇 曾軍

?基礎研究?

鎳鈦合金裸支架對內皮細胞低密度脂蛋白穿胞影響的初步研究

陶然 熊斌 鄭傳勝 梁明 王奇 曾軍

目的 探討鎳鈦合金裸支架是否影響低密度脂蛋白（LDL）在人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）中的穿胞并初步探討可能的機制。方法 ①培養HUVEC，利用細胞培養小池模擬血管內皮單層細胞，建立穿胞模型；②將鎳鈦合金裸支架作用于HUVEC上，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的LDL，分別培養3 h及24 h；③通過測定培養小池內外FITC-LDL的量，研究鎳鈦合金裸支架對LDL在HUVEC中穿胞過程的影響。結果 3 h及24 h時鎳鈦合金裸支架作用下LDL在HUVEC中的穿胞量均增加。結論 在LDL和HUVEC構建的穿胞模型實驗中, 鎳鈦合金裸支架可以促進LDL的穿胞。

低密度脂蛋白； 支架； 人臍靜脈內皮細胞； 穿胞

隨著生活水平的不斷提高，血管性疾病（包括心血管疾病、腦血管疾病、外周血管疾病等）的發病率不斷升高，動脈支架置入術的應用雖減少了心腦血管事件的發生，但有20%～30%的金屬裸支架植入患者在6個月內出現了支架內再狹窄（in-stent restenosis，ISR）[1]，使用藥物涂層支架可使再狹窄發生率降至7%[2]，但遠期再狹窄率與普通金屬裸支架并無差別[3]。

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是許多心腦血管疾病的病理基礎，大量研究表明血管內皮細胞功能障礙是AS的始發事件[4]，當內皮細胞功能受損時，氧化型低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein, ox-LDL)的增加，啟動了粥樣斑塊的形成和發展，繼而導致了血管的狹窄[5]。內皮細胞的功能障礙作為AS發生的重要原因在支架置入術后并未得到相應改善，相反，支架對血管內皮的作用可能進一步加重了血管內皮細胞的功能障礙，動物實驗顯示再狹窄的嚴重程度與內皮細胞功能密切相關，臨床的隨訪中也發現支架置入術后內皮細胞功能障礙較球囊擴張成形術更為嚴重[6]。我們推測支架可能引起或加重了內皮細胞的功能障礙，導致更多LDL通過內皮細胞并在內膜下氧化，形成更多的ox-LDL，從而引起泡沫細胞形成、炎癥反應等一系列改變，最后導致粥樣斑塊的形成，加重AS進程，并可能誘發新的AS，最終引起或參與血管支架內的再狹窄。

為了證實我們的推測，我們制備了LDL穿過人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的LDL穿胞模型[7]，觀察鎳鈦合金支架是否影響了低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）穿胞作用。實驗中，我們采用HUVEC作為研究對象，因其具有血管內皮細胞的各種功能，可以被作為研究血管疾病的工具[8]。

材料與方法

一、支架

Covidien公司生產的ev3鎳鈦合金記憶支架。

二、主要試劑與儀器

內皮細胞培養基（ECM，ScienCell公司），胎牛血清（FBS HyClone公司），胰酶（Amresco公司），鏈-青霉素，LDL，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），Transwell，超凈工作臺，細胞培養箱（37℃，5%CO2），高壓鍋，離心機，水浴箱，烤箱，光學顯微鏡，掃描電子顯微鏡（SEM），全波長熒光酶標儀（USA）。

三、實驗方法

1. HUVEC細胞培養：體外培養HUVEC，細胞生長于含l0%胎牛血清及1%的青-鏈霉素的ECM培養瓶內，在5%CO2、37℃培養箱中孵育，使用含0.25% EDTA的胰酶消化細胞，每1～2天換液一次，3～4天傳代一次，光學顯微鏡下觀察細胞生長狀態。

2. 支架材料的處理：將支架材料裁剪成直徑長約8 mm、寬約5 mm的小方片，每次使用前均需經超聲及高壓消毒，使用時將其置于Transwell的內室小池中。

3. FITC標記：LDL 實驗前使用FITC對LDL進行熒光標記，4℃避光保存。

4. HUVEC與鎳鈦合金支架材料聯合培養（支架對穿胞作用影響）傳至第2～3代的HUVEC，使用胰酶將其從細胞培養瓶中消化下來，并均勻種植于直徑為24 mm的Transwell的細胞培養小池中，37℃、5%CO2培養箱中孵育，隔天換1次培養液，待1～2天細胞附壁生長并形成致密單層，光鏡下觀察細胞融合情況，支架處理前需使用無血清ECM對細胞進行培養，待觀察到融合率達到90%左右，將鎳鈦合金支架輕輕平鋪于單層HUVEC上，空白對照組不加入支架材料，在每組加入FITC標記的LDL，待培養第3 h及24 h后，取每組孔中液體樣本于酶標板，注意盡量避光條件，使用酶標儀測量熒光OD值，計算外室的LDL含量,最終得出LDL的穿胞量。

四、統計學分析

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，所有數據均以x±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

支架作用HUVEC 3 h及24 h，LDL的穿胞量均有所增加。

圖1 鎳鈦合金支架作用3h，LDL穿胞結果

圖2 鎳鈦合金支架作用24h，LDL穿胞結果

討 論

本實驗中，3 h及24 h鎳鈦合金支架作用組LDL的穿胞量均增加。通常認為，LDL主要是在血管壁的內皮下層被氧化，變成ox-LDL，之后被血管內皮細胞吸收；ox-LDL通過炎癥與免疫因素的一系列復雜的相互作用，以細胞死亡的方式導致脂質堆積加速和泡沫細胞形成，最終促進AS的發生和發展。

ox-LDL對內皮細胞有較強的損害作用，機制包括：①通過細胞毒性作用損傷內皮細胞，ox-LDL對血管內皮組織、平滑肌細胞有較強的毒性，引起內皮細胞功能障礙和通透性增高。一方面ox-LDL釋放的溶血卵磷脂進入內皮細胞膜，改變血管的生理作用,使血管對一些松弛因子失去反應；另一方面ox-LDL脂質過氧化物能使動脈內皮細胞、平滑肌細胞壞死，并增強脂質蛋白對動脈壁的通透性。②參與氧化應激，ox-LDL通過各種途徑導致體內一氧化氮（NO）大量失活,從而減弱NO清除超氧化物的作用，進一步引起LDL的氧化,另外ox-LDL的細胞毒性作用可造成NO合成減少，進一步加重氧化應激對血管內皮的損傷。

目前研究多認為支架植入術后再狹窄的發生主要是因為內皮細胞大量增生[9]，在本實驗中，鎳鈦合金支架植入后，LDL的穿胞量增加，可能是支架作用損傷內皮細胞所致。研究表明，血管內皮細胞受損會導致過多的LDL經過受體介導遷入內皮下被氧化，形成氧化修飾的低密度脂蛋白，巨噬細胞及平滑肌細胞吞噬ox-LDL后形成泡沫細胞，同時合并血管炎癥、纖維增殖等反應，在病理學上表現為脂紋、粥樣斑塊和纖維斑塊形成，促進了AS的發展，并誘發新的AS病變形成[5，10]。我們推測，ISR的原因不僅是內皮細胞的增生，支架植入后對局部血管粥樣硬化病理進程的誘發和促進也是可能的原因之一。

針對支架作用并損傷內皮細胞可能發生的機制，我們嘗試使用鎳鈦合金支架組及空白對照組作用于HUVEC，培養3 h及24 h后收集細胞，使用Western-blot技術檢測實驗組及對照組cavoline-1及eNOS的表達情況，暫未得出穩定陽性結果，仍需多次重復并改進實驗。

本實驗均為體外鎳鈦合金支架直接作用于HUVEC，尚需鎳鈦合金支架作用動物實驗進一步證實和了解支架植入后的粥樣硬化病理進程。我們期待，通過實驗研究揭示粥樣硬化在支架植入術后再狹窄中可能的機制及應對策略，為介入治療血管閉塞性疾病提供新的視角和策略。

1 Sprague EA. In vivo cardiovascular assays for drug discovery: evolution of the drug-eluting stent[J]. Curr Opin Investig Drugs, 2007,8(3):219-225.

2 Philippe F, Dibie A, Larrazet F, et al. Drug eluting stents:from evidence based medicine to clinical practice[J]. Ann Cardiol Angiol, 2005, 54(4): 201-211.

3 Mauri L, Hsieh WH, Massaro JM, et al. Stent thrombosis in randomized clinical trials of drug-eluting stents[J]. N Engl J Med, 2007, 356(10):1020-1029.

4 Lei YP, Chen HW, Sheen LY, et al. Diallyl disulfde and diallyl trisulfde suppress oxidized LDL-induced vascular cell adhesion molecule and E-selectin expression through protein kinase A-and B-dependent signaling pathways[J]. J Nutr, 2008, 138(6):996-1003.

5 Keaney JF Jr. Atherosclerosis: from lesion formation to plaque activation and endothelial dysfunction[J]. Molecular Aspects of Medicine, 2000, 21(4-5):99-166．

6 van Beusekom HM, Whelan DM, Hofma SH, et al. Long-term endothelial dysfunction is more pronounced after stenting than after balloon angioplasty in porcine coronary arteries[J]. J Am Coll Cardiol, 1998, 32(4):1109-1117.

7 Bian F, Yang X, Zhou F, et al. CRP promotes atherosclerosis by increasing LDL transcytosis across endothelial cells[J]. Br J Pharmacol, 2014, 171(10):2671-2684.

8 Biff W.L, Moore EE, Moore FA, et al. Nitric oxide reduces endothelial expression of intercellular adhesion molecule (ICAM)-1[J]. J Surg Res, 1996,63(1):328-32.

9 Chandrasekar B, Mummidis S, Mahimainathan L, et al. Interleukin-18-included human coronary artery smooth muscle cell migration is dependent on NF-kappaB-and AP-1-mediated matrix metalloproteinase-9 expression and is inhibited by atorvastatin[J]. J Biol Chem, 2006, 281(22):15099-15109.

10 Goldschmidt-Clermont PJ, Greager MA, Losordo DW et a1. Atherosclerosis 2005 Recent Discoveries and Novel Hypotheses[J]. Circulation, 2005, 112(21):3348-3353.

Prliminary study of effects of Ni-Ti alloy stent on the low density lipoprotein transcytosis process

Tao Ran,Xiong Bin, Zheng Chuansheng, Liang Ming, Wang Qi, Zeng Jun. Department of Radiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China Corresponding author: Xiong Bin, Email: herrxiong@126.com

Objective To explore the effects of Ni-Ti alloy stent on the low density lipoprotein (LDL) transcytosis process in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and underlying mechanism. Methods①Culturing the HUVEC and use transwell to establish in vitro transcytosis model, simulating the endothelial cell monolayer of blood vessels. ②Puting the Ni-Ti alloy stent on the HUVEC, adding LDL labeled by fuorescein isothiocyanate (FITC), culturing for 4 h and 24 h. ③By measuring the fuorescencent intensity of FITC in and out of the chamber to refect the changes of transcytosis of LDL, investigating the effect of the Ni-Ti alloy stent on the LDL transcytosis process. Results The Ni-Ti alloy stent increase the transcytosis in 3 h and 24 h. Conclusions Using the trancytosis model constituted by LDL and HUVEC, Ni-Ti alloy stent can promote the trancytosis of LDL.

Low density lipoprotein; Stents; Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC); Transcytosis

2013-11-4）

（本文編輯：黃強）

10.3877/cma.j.issn.2095-5782.2014.02.001

武漢市應用基礎研究計劃項目（2014060101010038）

430022 武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院放射科

熊斌，Email：herrxiong@126.com