一種新型糖磷酸異構酶在大腸桿菌中的重組表達

馮再平，沐萬孟，江 波，* ，薛 冬

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122;2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050;3.太極集團浙江東方制藥有限公司，浙江紹興312000)

D－阿洛糖是一種無毒、無卡路里，具有重要生理功能的稀有糖，是 D－阿洛酮糖的醛糖異構體［1］。D－阿洛糖的生理功能包括:能夠抑制不同來源的癌細胞系［2－5］、抗氧化［6］、抗高血壓［7］、保護局部缺血傷害［8］、用作動物細胞抗凍劑［9］、用于器官移植的免疫抑制［10］等。D－阿洛糖優異的抑癌作用，以及在癌癥治療中與放療［11］、化療［12］等手段同時使用時顯著的協同輔助治療作用，使其成為近年來功能性稀有糖研究中的熱點。而一種新型的糖磷酸異構酶——核糖－5－磷酸異構酶 B(ribose－5－phosphate isomerase，RpiB，EC 5.3.1.6)［13］，可以可逆催化 D－阿洛酮糖和D－阿洛糖之間的酮醛糖異構化反應，是D－阿洛糖生物合成中的一類重要酶類。雖然該反應中用作底物的D－阿洛酮糖也是一種稀有糖，但是可以通過D－塔格糖－3－差向異構酶催化差向異構化反應，由較便宜的D－果糖獲得［14］。韓國建國大學的Park研究組最先報道了Clostridium thermocellum來源的RpiB在大腸桿菌中表達后，具有產D－阿洛糖的生物活性［15］;在此基礎上又研究了Clostridium thermocellum RpiB的 底 物 特 異 性［16］及 定 點 突 變［17］。 本 研 究 以Thermotoga lettingae TMO基因組為模板，構建獲得重組質粒pET22b－tl－rpib，并在大腸桿菌中成功實現表達。表達產物重組RpiB及含有重組質粒的大腸桿菌基因工程菌，均具有產D－阿洛糖的生物活性，可作為工業化生產高附加值的稀有糖——D－阿洛糖的備選生物催化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、引物、質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒 均購自生工生物工程(上海)有限公司;Thermotoga lettingae TMO菌株BAA－301 購自美國典型培養物保藏中心(American type culture collection，ATCC);PMD19－ T Simple Vector、DL10，000 DNA Marker、蛋白分子量標準(低)、限制性內切酶Nde I和Xho I、Premix TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Isopropyl β－D－1－thiogalactopyranoside(IPTG)等 購于TaKaRa公司;Chelating Sepharose Fast Flow、Sephdex G25 購自GE;D－阿洛酮糖、D－阿洛糖標準品購于Sigma公司;克隆載體pET－22b(+)中國科學技術大學生命科學學院王玉珍教授惠贈。

AuthorizedThermalCyclerPCR儀 德國eppendorf;Agilent1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司;核酸蛋白電泳電源系統、凝膠成像系統美國Bio Rad;5904R冷凍離心機 美國Beckman。

1.2 實驗方法

1.2.1 Thermotoga lettingae TMO RpiB的基因擴增依據Thermotoga lettingae TMO RpiB基因序列設計引物，在上下游引物5'端分別引入Nde I和Xho I的酶切位點。引物序列如下:

引物1:5'－GCCATATGAAGATAGCCATCGG TTGTGAC－3'

引物2:5'－CATGCTCGAGTTTATCCATCTCC TCAATCT－3'

以Thermotoga lettingae TMO菌液DNA為模板，PCR擴增 RpiB基因。擴增條件為:94℃預變性5min;98℃ 變性 10s，58℃ 退火延伸 30s，72℃ 延伸1min，進行30個循環，4℃保藏。

1.2.2 PCR產物的亞克隆、鑒定 用膠回收試劑盒回收PCR產物，然后將純化產物連接至PMD19－T Simple Vector，轉化宿主菌 E.coli DH5α，涂布于藍白斑篩選平板，37℃培養過夜。選取白色菌落接種至LB液體培養基(含50μg/mL氨芐抗生素)中，37℃、200r/min培養過夜，抽提質粒并測序鑒定。將鑒定為陽性克隆的重組質粒命名為T－tl－rpib。

1.2.3 Thermotoga lettingae TMO RpiB基因工程菌的構建 將T－tl－rpib及質粒 pET－22b(+)分別用限制性內切酶Nde I和Xho I處理，回收目的片段后，加T4 DNA連接酶進行連接反應，產物轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞。通過篩選與鑒定，獲得重組質粒陽性克隆，重組質粒命名為pET22b－tl－rpib，重組工程菌命名為 E.coli BL21/pET22b－tl－rpib。

1.2.4 Thermotoga lettingae TMO RpiB的誘導表達挑取重組菌E.coli BL21/pET－22b－tl－rpib單菌落接種至裝有適量LB液體培養基(含50μg/mL氨芐抗生素)的試管中，37℃下200r/min培養過夜。再按2%接種量將其接種至大體積的LB培養基中，同條件下振蕩培養，當菌體的OD600值為0.6～0.8時，加入一定濃度的IPTG，在較低溫度下誘導蛋白的表達。選取誘導表達中比較重要的三個影響因素(誘導劑的濃度、誘導時間、誘導溫度)，進行表達條件優化實驗。測定誘導劑濃度及誘導溫度對蛋白表達的影響時，誘導時間取4h，分別比較了20℃和28℃下，誘導劑 IPTG 濃度為0、0.5、1.0、2.0mmol/L 時，重組蛋白表達的情況;測定誘導時間的影響時，誘導溫度取28℃，IPTG濃度取0.5mmol/L。誘導后的菌液，加入SDS樣品緩沖液，混勻后煮沸幾分鐘，高速離心約1min，取20μL上清液進行SDS－PAGE電泳分析(4%濃度的濃縮膠，15%濃度的分離膠)。

1.2.5 Thermotoga lettingae TMO RpiB的分離純化

低溫離心(8000×g，15min，4℃)收集菌體，然后以平衡緩沖液(200mmol/L NaCl，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4)重懸菌體，超聲破碎大腸桿菌細胞10min(250W，開1s/關2s)后，低溫離心(10000 ×g，30min，4℃)棄細胞碎片，收集上清液進行以下層析純化。采用Ni2+－Chelating Sepharose Fast Flow親和層析柱(1.0cm×10.0cm)，對重組 Thermotoga lettingae TMO RpiB進行純化。上柱前預先用平衡液平衡層析柱，蛋白酶液上柱后以洗滌液(平衡液+200mmol/L咪唑)洗脫雜蛋白，再用洗脫液(平衡液+500mmol/L咪唑)洗脫重組蛋白，SDS－PAGE進行電泳分析。收集的重組蛋白洗脫液過Sephdex G25脫鹽柱脫鹽，超濾濃縮至適當體積，用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.2.6 產D－阿洛糖活性鑒定 分別以250mmol/L的D－阿洛酮糖為反應底物，加入20mL發酵菌液相當量的E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細胞和分離純化得到的 Thermotoga lettingae TMO RpiB，在55℃，pH8.0的 100mmol/L Tris－HCl緩沖液中反應3h。轉化產物用Agilent 1200高效液相色譜儀進行測定，色譜條件為:糖柱 Waters Sugarpak－1;Shodex示差折光檢測器;流動相為純水;流速為0.4mL/min;柱溫為85℃;進樣量為10μL。

2 結果與分析

2.1 Thermotoga lettingae TMO RpiB基因的PCR擴增、克隆及鑒定

以Thermotoga lettingae TMO菌液為模板，擴增出了一條約450bp的條帶，與預期的擴增產物大小吻合(圖1)。測序結果與NCBI(登錄號:ABV32911.1)中的已知基因完全吻合。

圖1 Thermotoga lettingae TMO RpiB基因的PCR擴增片段檢測Fig.1 Analysis of Thermotoga lettingae TMO RpiB amplied by PCR

分別用Xho I單酶切質粒pET－22b(+)和重組質粒 pET22b－tl－rpib，用 Nde I、Xho I雙酶切重組質粒pET22b－tl－rpib(圖2)。雙酶切重組質粒得到兩個片段，其中大片段與線性pET－22b(+)大小相當，450bp有一微弱條帶為小片段，與編碼Thermotoga lettingae TMO RpiB基因大小相同，表明重組質粒構建成功。

圖2 重組質粒pET22b－tl－rpib的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pET22b－tl－rpib

2.2 基因工程菌的誘導表達

為了獲得大量目的蛋白，選擇誘導劑濃度、誘導時間、誘導溫度三個因素對重組菌 E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的誘導表達進行了優化。表達產物SDS－PAGE分析結果顯示約在17ku處有明顯特征條帶(圖3)，與重組蛋白分子量的理論計算值相符。28℃誘導獲得的目的蛋白明顯多于20℃誘導獲得的目的蛋白，而隨著誘導劑濃度增加目的蛋白表達量增加的趨勢在兩個溫度是一樣的(圖3a)。在酶活測定中，28℃誘導劑IPTG終濃度為1.0mmol/L時的酶活要高于2.0mmol/L時的酶活，可能是因為誘導劑濃度較高時，部分目的蛋白以包涵體形式存在而降低了酶活。在28℃溫度下，1mmol/L的IPTG誘導6h可達到最高表達產物量(圖3b)，6h以后，隨著誘導時間的延長，誘導量不再增加，這一結果與酶活測定結果是一致的，可能是培養基中營養物質耗盡，到一定時間后蛋白質分解速度大于合成。

2.3 重組RpiB的分離純化

對Ni2+－Chelating Sepharose Fast Flow純化后得到目的蛋白進行SDS－PAGE分析，其純度達到電泳純(圖4)。在用50mmol/L pH8.0的磷酸緩沖液對收集到的目的蛋白進行4℃過夜透析處理時發現，蛋白聚集沉淀現象較明顯，采用Sephdex G25脫鹽柱快速脫鹽可避免這一現象。分析其原因，可能是因為該蛋白以二聚體形式存在，其存在形式與聚集狀態易受pH、離子強度的影響。在透析脫鹽過程中，含目的蛋白的溶液體系中咪唑含量不斷減少使體系pH持續變化，離子強度也在不斷下降，且透析處理所需時間較長，這些都可能導致重組蛋白不穩定而聚集沉淀。G25脫鹽柱充分平衡后進行脫鹽，能夠提供較為穩定的溶液環境，且在較短的時間內完成了目的蛋白緩沖液的置換，可以緩解蛋白的沉淀。而影響該重組蛋白存在形式與聚集狀態的具體因素、聚集作用機理等，有待進一步實驗研究。

圖3 重組質粒pET22b－tl－rpib在E.coli BL21(DE3)中的表達Fig.3 pET22b－tl－rpib expression in E.coli BL21(DE3)

圖4 SDS－PAGE電泳分析純化后的目的蛋白Fig.4 SDS－PAGE analysis of the purified target protein

2.4 產D－阿洛糖活性鑒定

工程菌E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細胞(圖5b)及分離純化得到的Thermotoga lettingae TMO RpiB(圖5c)均可催化D－阿洛酮糖轉化成D－阿洛糖。相當量的純化后的重組 Thermotoga lettingae TMO RpiB的底物轉化率(23%)要高于工程菌E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細胞的底物轉化率(19%)，可能是因為D－阿洛糖可以參與E.coli的磷酸戊糖支路的代謝［18］而被消耗掉了一部分。兩者都具有產D－阿洛糖的生物活性，而利用工程菌E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細胞進行生物轉化時，無需復雜的蛋白質提取、分離純化過程，且底物轉化率也較為可觀，有生產操作的可行性，可以作為功能性稀有糖D－阿洛糖的生產用生物催化劑，應該在后續的工作中深入研究。

圖5 重組Thermotoga lettingae TMO RpiB的酶活鑒定Fig.5 Enzyme activity analysis of the recombinant Thermotoga lettingae TMO RpiB

3 結論

D－阿洛糖是一種具有重要生理功能及應用前景的稀有糖，在自然界存在量稀少，而化學合成法副產物多，污染大。生物轉化法生產D－阿洛糖技術的出現，使這種具有抑癌功能的稀有糖之大規模生產成為可能。

本研究以Thermotoga lettingae TMO的基因組DNA為模版，通過菌液PCR及基因克隆技術獲得了工程菌 E.coli BL21/pET22b－tl－rpib。在 28℃溫度下，添加1mmol/L的IPTG，誘導6h，表達產物達到最大量。經親和層析純化的蛋白酶液進行SDS－PAGE電泳分析，約在17ku處出現單一特征條帶，證明了Thermotoga lettingae TMO RpiB在大腸桿菌中得到了正確的表達。同時對重組Thermotoga lettingae TMO RpiB催化D－阿洛酮糖生成D－阿洛糖的活性進行了研究，發現在 55℃條件下，工程菌 E.coli BL21/pET22b－tl－rpib的靜息細胞催化反應3h后轉化率可達19%，說明該工程菌有希望用于生物轉化法大規模生產新型功能性稀有糖D－阿洛糖。

定點突變技術可以大幅提高RpiB的催化效率［17］。下一步我們將對 Thermotoga lettingae TMO RpiB的催化機理進行研究，并嘗試定點突變結合相關基團，改變酶與底物結合的強度，從而進一步提高酶活，得到更高效的產D－阿洛糖生物催化劑。

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