酸脅迫對干酪乳桿菌細胞膜生理特性的影響

吳重德，何桂強，張娟，周榮清，堵國成，陳堅

(1.四川大學輕紡與食品學院，皮革化學與工程教育部重點實驗室，四川成都610065；2.江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類可發酵碳水化合物并以乳酸為主要產物的革蘭氏陽性桿菌或球菌的總稱。作為工業化的細胞工廠，乳酸菌菌體及其代謝產物廣泛應用于食品、醫藥、飼料、精細化學品等工業領域[1,2]。尤其在食品工業中，乳酸菌廣泛應用于生產乳制品、香精香料、氨基酸、多糖、生物活性物質(葉酸、共軛亞油酸)、防腐劑等[2]。然而乳酸菌在發酵生產、工業應用以及作為益生菌在人體胃腸道系統中都會面臨各種環境脅迫，包括酸脅迫、鹽脅迫、鹽脅迫、冷凍脅迫等，這些環境脅迫嚴重影響了乳酸菌的生長、代謝以及生理功能，從而影響了食品微生物制造的效率和益生功能的發揮。因此，如何提高乳酸菌對各種環境脅迫的抗性，已成為學術界和產業界共同關注的焦點問題。

在各種環境脅迫中，酸脅迫是對乳酸菌最為嚴峻的脅迫挑戰之一。在乳酸菌的發酵生產以及在人體胃液中都會遭遇酸脅迫的影響。酸脅迫條件下，乳酸菌通過調控胞內pH的動態平衡、誘導表達脅迫應激蛋白以及調節細胞膜的生理功能等減少酸脅迫對細胞造成的損傷[3-5]。

細胞膜是將細胞與外界分開的第一道屏障，在細胞的生長、代謝、能量傳導以及維持胞內微環境穩定等方面具有重要作用；同時，細胞膜也是環境脅迫作用的首要位點[6,7]。因此，保持細胞膜的功能對于保持細胞活性，提高細胞對環境脅迫的抗性具有重要影響。本論文干酪乳桿菌為研究對象，考察了酸脅迫對細胞膜生理特性的影響，研究結果為進一步調控細胞膜生理功能提升乳酸菌環境脅迫抗性奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Zhang） 內蒙古農業大學張和平教授惠贈；MRS培養基 購自Oxoid公司；DPH（1,6-二苯基-1,3,5-己三烯）、嵌二萘（pyrene） 購自Sigma-Aldrich（上海）公司；ONPG（鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷） 購自碧云天生物技術研究所；其余試劑 均為國產分析純。

M6原子吸收分光光度計 日本島津公司；GC-14A氣相色譜儀 日本島津公司；Q-Mass 910型質譜儀 加拿大 Sciex公司；650-60熒光分光光度計 日本日立公司；蛋白核酸定量儀 德國Eppendorf公司，UV2450紫外可見分光光度計 日本島津公司；BIOFLO發酵罐 美國NBS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物培養條件 以 2%接種量取-70℃甘油貯存液接種于 MRS培養基，37℃靜置培養12-14h后，作為活化種子，以2%接種量將培養好的種子液接種至1.3L發酵罐中進行恒化培養，發酵罐裝液量為600mL，溫度37℃，攪拌轉速100r/min稀釋率為0.1h-1，通過添加2mol/L NaOH控制發酵罐pH為6.5。

1.2.2 脅迫處理 收集恒化培養至穩態的細胞(OD3.0)，離心(10000g，4℃)5min，細胞經0.85%的生理鹽水洗滌兩次后重懸于等體積的pH3.5的MRS培養基中，脅迫不同時間后測定相關生理參數。

1.2.3 細胞膜脂肪酸含量的測定 細胞膜脂肪酸的制備和氣相色譜分析條件按照文獻[8]的方法進行。碳鏈長度的計算按如下公式進行：

式中：FAP：脂肪酸組成百分數

C：脂肪酸碳原子數

1.2.4 細胞膜流動性的測定 細胞膜側向擴散速率和微黏度的測定按照 Aricha等[9]的方法進行。取脅迫后的菌體，調節菌體濃度至OD450=0.3，用0.25%甲醛37℃固定0.5h，菌體用0.2mol/L磷酸緩沖液（pH7.4，含 0.25%甲醛）離心洗滌兩次。對于側向擴散的測定，細胞用0.1-0.5μmol/L二萘于37℃標記40min，用熒光分光光度計測定熒光強度，激發波長335nm，發射波長373nm（單體）和470nm（二聚體），狹縫均為5nm。根據熒光探針濃度和470nm波長處熒光強度和373nm波長處熒光強度的比值作圖，斜率即為側向擴散速率Ka。對于微黏度的測定，細胞用5×10-6mol/L DPH于37℃溫浴1h，用熒光分光光度計測定熒光強度，加偏振裝置。激發波長360nm，發射波長430nm，狹縫均為5nm。熒光偏振度P和微黏度r的計算公式如下：

式中：

IVV：起偏器和檢偏器光軸同為垂直方向時所測得的熒光強度；

IVH：起偏器和檢偏器光軸分別為垂直和水平方向時所測得的熒光強度。

IHV：起偏器和檢偏器光軸分別為水平和垂直方向時所測得的熒光強度；

IHH：起偏器和檢偏器光軸同為水平方向時所測得的熒光強度。

P值越大，r值越大，流動性越小。

1.2.5 細胞內膜透性的測定 取恒化培養至穩態的細胞按照 1.2.2的方法脅迫 1h后用10mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）離心洗滌兩次后重懸于相同緩沖液并調節細胞濃度為OD600=1.0，取1mL稀釋的菌液添加OPNG至終濃度為100μg/mL，用分光光度計測定420nm條件下吸光值隨時間的變化[10]。

1.2.6 胞內金屬離子含量的測定 取5mL恒化培養至穩態的的細胞按照1.2.2的方法脅迫1h后用超純水離心洗滌（10000g，4℃，5min）三次。棄上清后向沉淀中加入4mL 濃硝酸煮沸直至溶液透明澄清，加水定容至25mL，用原子吸收分光光度計按照Neves等[11]的方法測定胞內Na+、K+和Ca2+離子濃度。

1.2.7 統計分析 每個條件做3個平行樣，每個樣品測定均為3次重復，結果表示為平均值±標準偏差，使用SPSS17.0軟件對數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 酸脅迫對干酪乳桿菌細胞膜流動性的影響

圖1考察了干酪乳桿菌在酸脅迫條件下細胞膜流動性的變化。膜的側向擴散速率以嵌二萘為熒光探針，根據嵌二萘單體和激發態二聚體的熒光強度的比值進行測定。如圖1A所示，隨著脅迫pH的降低，側向擴散系數Ka逐漸降低，表明酸脅迫引起細胞膜側向擴散速率降低；圖1B考察了酸脅迫條件下細胞膜微黏度的變化，隨著脅迫pH的降低，細胞膜微黏度逐漸增加，表明細胞膜流動性降低。合適的膜流動性對于維持細胞生理功能具有重要作用，膜的流動性與能量轉化、物質運送、信息傳遞等密切相關，它是膜脂肪酸鏈的構造、膜的側向擴散、軸向擴散、翻轉擴散(flip-flop)等的綜合反映[6,12]。當對細胞施加一定的環境脅迫時，通常會導致膜的結構、組織以及膜脂的功能發生一定變化，同時膜流動性降低可以減少乳酸的進入對細胞造成的傷害。

圖1 酸脅迫對細胞膜側向擴散系數(A)和微黏度(B)的影響圖柱上方星號表示與對照(脅迫前)比較具有顯著性差異(p＜0.05)Fig. 1 Effects of acid stress on lateral diffusion coefficient (A)and micro-viscosity (B)of cell membrane. Asterisks indicate the level of statistical significance (p＜0.05)in comparison to the control (before acid stress).

2.2 酸脅迫對細胞膜透性的影響

以ONPG為內膜探針，測定了干酪乳桿菌細胞內膜的透性（圖2）。ONPG是β-半乳糖苷酶的底物，當細胞內膜不完整時ONPG會很快進入胞內，并被胞內的β-半乳糖苷酶所降解，降解產物呈現黃色并在420nm波長下具有最大吸收峰，因此可以用吸光值的大小和上升速率來評價內膜透性的大小[10]。如圖2所示，隨著時間的增加，在420nm下的吸光度逐漸增加，經酸脅迫后的細胞具有更高地吸光值和更快地上升速率，表明細胞經酸脅迫后細胞內膜滲透性增加。

圖2 酸脅迫對細胞內膜透性的影響Fig. 2 Effect of acid stress on inner membrane permeability of L. casei.

為了進一步對上述結果進行驗證，實驗考察了脅迫前后胞內金屬離子濃度的變化，如表1所示，所考察的三種金屬離子Na+，K+，Ca2+在脅迫后胞內濃度顯著降低，表明細胞經酸處理后細胞膜結構受到破壞，細胞膜透性增加。Wu等[4]通過投射電鏡也發現了相似的結論，經酸處理后干酪乳桿菌細胞膜厚度變薄，表面變得粗糙，部分細胞膜破裂，并有部分胞內物質的外溢。

表1 酸脅迫前后胞內金屬離子濃度的變化Table 1 Changes in concentrations of intracellular metal ions upon acid treatment

2.3 酸脅迫對細胞膜脂肪酸組成的影響

圖3考察了酸脅迫對細胞膜脂肪酸組成的影響。如圖所示，酸脅迫引起干酪乳桿菌細胞膜飽和脂肪酸（C14:0，C15:0，C16:0）比例降低，而不飽和脂肪酸除 C16:1外都有不同程度的增加。進一步分析脂肪酸不飽和度和碳鏈長度，結果表明，隨著脅迫時間的增加，細胞膜不飽和度逐漸增加，脅迫45min，不飽和度達到最大；同時，脅迫時間延長，膜脂碳鏈長度逐漸增加，脅迫45min后，碳鏈長度由15.55增加到16.53（圖4）。

圖3 酸脅迫對細胞膜脂肪酸組成的影響圖柱上方星號表示與對照(脅迫前)比較具有顯著性差異(p＜0.05)。Fig. 3 Effect of acid stress on membrane fatty acid compositions Asterisks indicate the level of statistical significance (P＜0.05)in comparison to the control(before acid stress).

圖4 酸脅迫下細胞膜脂肪酸不飽和度和平均碳鏈長度的變化圖柱上方星號表示與對照(脅迫前)比較具有顯著性差異(p＜0.05)。Fig. 4 Changes in ratio of unsaturated/saturated fatty acids and mean chain length during acid stress. Asterisks indicate the level of statistical significance (P＜0.05)in comparison to the control(before acid stress).

調節膜脂肪酸分布是細胞抵御環境脅迫的重要機制之一，當面臨環境脅迫時，細胞可以通過改變(1)不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例(不飽和度，U/S ratio)；(2)順式和反式脂肪酸的比例；(3)支鏈和直鏈脂肪酸的比例以及(4)脂肪酸長度來改變細胞膜脂肪酸的組成[6,13]。本研究的結果表明酸脅迫引起細胞膜不飽和脂肪酸含量、不飽和度和脂肪酸碳鏈長度都有一定程度的增加，這一研究結果與在其他微生物如變形鏈球菌(S. mutans)、格氏鏈球菌(S.gordonii)和唾液鏈球菌(S. salivarius)中報道的結果相一致[14,15]。通常增加膜脂的不飽和度需要去不飽和酶的參與，而去不飽和酶是一種依賴于氧的酶，它催化合成不飽和脂肪酸是一個耗氧的過程，這樣可以減少由酸脅迫引起的氧脅迫對細胞造成的損傷[16-18]。此外，Fozo和Quivey[14]還報道了不飽和脂肪酸的形成對于保持胞內外的pH梯度具有重要作用。脂肪酸碳鏈長度的改變是改變細胞膜脂肪酸組成的一種途徑，在口腔細菌 S. gordonii DL1和 S.salivarius 57.1中也發現了相似的結論[15]。Denich等[6]和Mykytczuk等[19]認為鏈長增加更容易橫跨膜雙分子層，使脂肪酸鏈更緊湊，而膜環境更接近于“凝膠狀”；而短鏈的脂肪酸不能橫跨膜雙分子層，也就不能和其它的脂和蛋白通過疏水關系結合，這樣由于游離脂肪酸的移動使膜的不穩定性增加。因此，增加脂肪酸的不飽和度和碳鏈長度是干酪乳桿菌的一種酸存活機制。

3 結論

細胞膜結構的完整性和流動性是保持細胞處于正常生理功能的重要條件。本論文以干酪乳桿菌為研究對象，考察了酸脅迫對細胞膜生理特性的影響。分別以嵌二萘和DPH為探針，考察了酸脅迫對細胞側向擴散速率和微黏度的影響。研究結果表明，隨著脅迫pH的降低，細胞膜側向擴散速率降低，微黏度增加，表明細胞膜流動性降低。降低的膜流動性減少了乳酸進入胞內對細胞造成的損傷。同時研究結果還表明酸脅迫導致細胞內膜透性增加，胞內金屬離子濃度顯著降低。分析細胞膜脂肪酸組分的變化，研究發現酸脅迫引起膜脂不飽和脂肪酸含量增加，飽和脂肪酸含量降低，不飽和度和脂肪酸碳鏈長度增加。

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