乳酸片球菌PA003抑菌作用及體外耐受性的研究

董婷，周志江，韓燁

（天津大學化工學院，天津 300072）

乳酸菌是一類能利用碳水化合物產生乳酸的非病原性、革蘭氏染色陽性菌的通稱，包括乳桿菌、乳球菌和雙歧桿菌等至少23個屬。乳酸菌具有改善、調節(jié)人體腸道微生物菌群的平衡，增強機體免疫力，降低膽固醇水平，緩解乳糖不耐癥等功能。一些乳酸菌是人和動物的胃腸道和雌性生殖道的共生菌，可以促進人和動物的健康［1］。此外，乳酸菌作為重要的益生菌已廣泛地用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)中，被公認為是安全的食品級微生物［2］。目前，已從人的糞便、酸馬奶、發(fā)酵香腸、羊的瘤胃、牛糞、牛初乳、酸白菜、真空包裝的發(fā)酵肉等分離到乳酸片球菌[3]。Gonzalez等[4]對來源于Pediococcus acidilactici PAC1.0片球菌素PA-1的研究發(fā)現，乳酸片球菌素能抑制多種革蘭氏染色陽性菌，尤其是對單核細胞增多癥李氏桿菌的抑制較為明顯[5]。Bhunia等[6]對來源于Pediococcus acidilactici strain H的片球菌素AcH具有耐熱性，對蛋白酶敏感及在較寬的pH范圍有活性進行了研究。對乳酸片球菌素的研究主要包括：基因結構、抑菌機理、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、純化及理化性質等［3］。Garmyn等[7-8]在轉錄水平上對乳酸片球菌的乳酸脫氫酶IdhD和IdhL進行了研究。1992年，Fitzsimons等[9]對18株乳酸片球菌進行了研究，并篩選到一株適合作為青貯接種菌的乳酸片球菌，此菌株表現較短的停滯期、產酸速度快、在較寬的pH和能溫度范圍生長等優(yōu)點。然而，目前對乳酸片球菌益生方面的研究還比較少，僅在細角濱對蝦[10]、斷奶仔豬[11]、蛋雞[12]、火雞[13]、羅非魚[14]等中有少量報道［3］。

乳酸片球菌 PA003是從東北發(fā)酵酸白菜中分離出的一株細菌素產生菌，對多數革蘭氏染色陽性菌和少數不耐酸的革蘭氏染色陰性菌有抑制作用［15］。其片球菌素產量為0.1760mg/mL，片球菌素的產量與很多因素有關，碳源和氮源是影響細菌素產生的主要因素，葡萄糖作為乳酸片球菌生長的主要碳源，其調節(jié)作用是乳酸片球菌素產量和活性的主要控制機制；而有機氮源的存在，可以滿足菌體生長，同時也能中和代謝抑制物乳酸，促進片球菌素的產生，增強其抑菌活性。Mg2+可增加片球菌素的產量，K2HPO4是產乳酸片球菌素很好的磷源，將其濃度提高到5%時，既可維持發(fā)酵液的pH在合適的范圍內，又可以刺激細菌素的產生。乳酸片球菌素的產量和抑菌活性在對數后期達到最大值，繼續(xù)延長時間，產量有不同程度的下降，其抑菌活性也會降低［16］。本試驗對其從抑菌、耐酸、耐膽鹽、耐高溫、耐抗生素等益生方面進行研究，以獲得抗逆性強、益生性能優(yōu)良，具有安全性的益生菌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）PA003，從東北發(fā)酵酸菜中分離獲得；單核細胞增多癥李氏桿菌（Listeria mononucleosis）CVCC1595，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），天津大學化工學院食品系保存； MRS培養(yǎng)基，用于乳酸片球菌的增殖培養(yǎng)； TYESB培養(yǎng)基，單核細胞增多癥李氏桿菌的增殖培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)基，大腸桿菌的增殖培養(yǎng)基；NB培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌和產氣腸桿菌的增殖培養(yǎng)基。

Oxoid抗微生物藥敏實驗紙片，購于OXOID公司。牛膽鹽，購于奧博星生物公司；

臺式恒溫振蕩器QE-1，購于天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化 將30%甘油（-80℃）保存的乳酸片球菌、單核細胞增多癥李氏桿菌、大腸桿菌、分別接種于MRS、TYSEB、LB液體培養(yǎng)基中，37℃下分別以120、200、120 r/min搖床培養(yǎng)14、7、10h［17］。將甘油保存的金黃色葡萄球菌、產氣腸桿菌分別接種于NB液體培養(yǎng)基中，37℃下以120 r/min、搖床培養(yǎng)10h。接種環(huán)分別蘸取少量乳酸片球菌、單核細胞增多癥李氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、產氣腸桿菌培養(yǎng)液于MRS、TYSEB、LB、NB培養(yǎng)基斜面上劃線培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng)24h。

1.2.2 乳酸片球菌生長曲線的測定 取1.2.1中活化好的乳酸片球菌種子液，以2%的接種量接種于液體MRS液體培養(yǎng)基中，37℃下分別以120r/min搖床培養(yǎng)，每隔2h取樣，稀釋后，利用可見分光光度計測OD值，所用波長為600nm。

1.2.3 抑菌試驗 將已滅菌的MRS培養(yǎng)基加熱至完全融化，取4個無菌培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)基倒在其中，每皿15mL，待其凝固。以無菌操作分別在每個培養(yǎng)基表面各放3個牛津杯（內徑6mm、外徑8mm、高 10mm），輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。分別將單核細胞增多癥李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產氣腸桿菌的菌液按接種量5%接種于降至40℃左右的TYESB、NB、LB、NB半固體培養(yǎng)基中，混勻后分別倒在四個平板內，待半固體凝固后取出牛津杯，在牛津杯所形成的小孔內各加入200μL乳酸片球菌的發(fā)酵液。37℃過夜培養(yǎng)，觀察小孔周圍抑菌圈，并用游標卡尺測量其直徑，從而分析乳酸片球菌對常見致病菌的抑菌效果［17］。

1.2.4 耐高溫試驗 在MRS液體培養(yǎng)基中接種2%已活化的乳酸片球菌，37℃過夜培養(yǎng)，菌液進行以下熱處理：50℃、80℃、100℃ 各5、10、15min［18］。以未經熱處理的菌液作為對照，對菌液進行梯度稀釋，然后平板計數，并記錄該菌在不同熱處理下的存活率。做3個平行求平均值。

1.2.5 耐酸試驗 將活化的乳酸片球菌以接種量10%分別接種于pH1.5、2.5、3.5、4.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，在0、2、4、6h后取樣，以未經酸處理的菌液作為對照，對菌液進行梯度稀釋，然后平板計數，并記錄該菌在不同酸度下的存活率。做3個平行求平均值。

1.2.6 耐膽鹽試驗 將活化的乳酸片球菌以接種量10%分別接種于膽鹽含量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，在0、2、4、6h后取樣，以未經膽鹽處理的菌液作為對照，對菌液進行梯度稀釋，然后平板計數，并記錄該菌在不同濃度膽鹽處理下的存活率。做3個平行求平均值。

1.2.6 藥敏性試驗 采用K-B法［19］，將浸有抗生素的試紙片貼在涂布有乳酸片球菌的MRS平板上，在貼上藥敏紙片的15min內翻轉平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，做3個平行求平均值。

1.3 數據處理

數據采用SPSS20.0軟件進行誤差計算和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸片球菌的生長曲線

將種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)，每隔2h取樣，測菌體OD值，以OD值為縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標，可以得到乳酸片球菌的生長曲線如圖1：

由圖1可知，在0-2h之間，乳酸片球菌PA003經過一個短暫的延滯期后，很快進入對數生長期，大約在14h時，菌體密度和乳酸片球菌素的產量及抑菌活性均達到最大值。隨著營養(yǎng)物質的消耗，有害代謝產物的積累，細菌繁殖速度逐漸下降，細菌的增殖數與死亡數漸趨平衡，此時進入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期后細菌繁殖越來越慢，死亡菌數增加，有的細菌甚至出現自溶現象，生理代謝活動也趨于停滯，此時細菌進入衰亡期。由于OD值表示的是培養(yǎng)液中的總菌數，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。

2.2 抑菌試驗

本試驗分別檢驗了乳酸片球菌PA003對單核細胞增多癥李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產氣腸桿菌的抑菌效果，抑菌效果如圖2、結果如表1所示，乳酸片球菌PA003對上述四種菌均有不同程度的抑制作用，其中對單核細胞增多癥李氏桿菌和產氣腸桿菌具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑大于17mm。乳酸片球菌對李氏桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用主要是由于片球菌素對革蘭氏染色陽性菌細胞壁的形成有抑制作用［15］，而對大腸桿菌和產氣腸桿菌等革蘭氏染色陰性菌主要是由于乳酸片球菌產生的乳酸等有機酸及競爭性抑制作用。一方面，氫離子濃度能夠引起微生物細胞膜電荷性質發(fā)生變化，進而影響微生物機體對某些營養(yǎng)物質的吸收；另一方面，氫離子濃度能夠影響微生物代謝過程中某些酶的活性，還能影響微生物生長環(huán)境中營養(yǎng)物質的供給態(tài)，以及菌體蛋白質變性或菌體表面或核酸的水解［20］。

圖2 乳酸片球菌的抑菌效果

表1 PA003對不同細菌的抑菌圈大小

2.3 耐高溫試驗

將乳酸片球菌進行不同時間、不同溫度的熱處理，觀察該菌對不同溫度的耐受性，其結果如表2和表3所示，由表2和表3可知，與對照（未經熱處理的菌液）相比，乳酸片球菌經100℃加熱5min處理后活菌數為(3.20±0.20)×103CFU/mL，存活率小于0.01%，10min后存活率為0。80℃5min、10min處理后其活菌數分別為(4.60±0.30)×103CFU/mL、(6.00±0.50)×10CFU/mL，存活率均小于0.01%，50℃5、10、15min 熱處理后其活菌數分別為(1.20±0.20)×109CFU/mL、(1.00±0.40)×109CFU/mL、(1.00±0.40)×109CFU/mL，存活率為100%、83.3%、83.3%，可見該菌對50℃熱處理有很好的耐受性。

表2 PA003在不同溫度條件下的活菌數（CFU/mL）

表3 PA003在不同溫度條件下的存活率（%）

15 100 83.3 -- --

2.4 耐酸試驗

將乳酸片球菌進行不同時間、不同pH的酸處理，觀察該菌對不同酸度的耐受性，結果見表4和表5。在pH 1.5時，2h后大部分菌死亡，說明該菌株對pH1.5耐受性差；在pH 2.5時，隨時間延長，活菌數有所下降，但在6h時存活數仍較高，可達(4.00±0.30)×106CFU/mL；在pH3.5、4.5和6.5時，其活菌數隨時間延長先減少后增加，說明pH 3.5、4.5和6.5對該菌株存活無抑制，開始的減少可能是由于該菌本身的遲滯期?？梢妏H 2.5、3.5、4.5對該菌株的存活無太大影響。

表4 PA003在不同pH條件下的活菌數（CFU/mL）

表5 PA003在不同pH條件下的存活率（%）

2.4 耐膽鹽試驗

將乳酸片球菌進行不同時間、不同膽鹽濃度的培養(yǎng)，觀察該菌對膽鹽的耐受性，結果見表6和表7。由表可知，在膽鹽濃度大于等于0.5%時，該菌在2h后存活率就低于0.01%。在膽鹽濃度0.1%～0.2%時，該菌的存活率均大于0.01%。該菌在0.1%～0.4%膽鹽的條件下生長6h，活菌數先減少后增加，這個一方面是由于膽鹽對該菌的生長有一定的抑制作用，另一方面也是由于該菌遲滯期的存在。說明在0.1%～0.4%膽鹽的條件乳酸片球菌對膽鹽具有較好的耐受性。

表6 PA003在不同濃度膽鹽中的活菌數（CFU/mL）

表7 PA003在不同濃度膽鹽中的存活率（%）

2.5 藥敏試驗

將乳酸片球菌接種于MRS平板上，分別取浸有諾氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素、青霉素和利福平5種抗生素的藥敏紙片用無菌鑷子貼在該平板上，37℃培養(yǎng) 24h，觀察并測量抑菌圈的大小。下圖3依次顯示了乳酸片球菌對5種抗生素的抗性，抑菌圈直徑如表8，分別為0、0、9.00、13.04、13.03mm，都處于革蘭氏染色陽性菌標準菌株對5種抗生素表現為耐藥性的抑菌圈直徑范圍。因此，乳酸片球菌對以上5種抗生素都具有耐藥性。

圖3 PA003對不同抗生素的耐藥性

表8 PA003對不同抗生素的耐藥性

3 討論

目前具有一定生理功能（如降血脂、降血壓、調節(jié)胃腸道功能和其他各種益生功能）的益生菌正受到越來越多的關注［21-23］。而對于益生菌而言，必須進入人體的胃腸道才能發(fā)揮其療效和功能，因此就要求益生菌能夠耐受機體的防御機制，其中也包括生產中可能產生的高溫環(huán)境、口腔中的酶、胃液的低pH和小腸中的膽鹽等［24］。

單核細胞增多癥李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、產氣腸桿菌是人體腸道內最常見的幾種致病菌，乳酸片球菌對這幾種菌均有明顯抑制作用，抑菌圈直徑都大于17mm。其產生的乳酸片球菌素和有機酸等，對這些致病菌起到了抑制作用。

益生菌株在菌液濃縮或制作顆粒料時，加熱處理是比較常用的方法，因此我們對耐酸、耐膽鹽能力較強的乳酸片球菌進行了熱耐受性試驗。結果顯示，50℃熱處理對該菌的存活幾乎無影響。在以后的生產加工過程中，可能會使用噴霧干燥技術對該菌進行濃縮。而噴霧干燥的高溫可能破壞菌體結構，從而影響其活性。正常人的胃液在pH1.5～4.5之間，其pH值的大小因食物結構不同而波動，通常在pH3.0左右，且食物（尤其是流體）通過胃的時間相對較短，一般1～2h［25］。在pH1.5時，該菌的存活率為0；在pH2.5～4.5時乳酸片球菌均表現出耐受性。這種對酸的耐受反應包括對新的pH的動態(tài)平衡和新的系列蛋白質，如抗性蛋白質的合成的感應。抗性蛋白質有助于提高菌體細胞對酸的耐受性的反應，進行全部或部分地保護細胞，以抵抗其他的壓力反應［26］。由此可見，乳酸片球菌具有較強的耐酸能力，能夠保證一定數量的活菌體順利通過胃酸環(huán)境到達腸道內。益生菌對于膽鹽的抗性是其能夠在腸道存活、生長并發(fā)揮功效的先決條件之一。膽鹽對菌株的抑制作用取決于膽鹽濃度和菌株本身的特性，人體小腸中膽鹽質量分數在0.03%～0.3%之間波動，能夠在正常生理膽鹽濃度中生長和代謝的菌株才可能在腸道消化過程中存活［27］。本研究中當膽鹽濃度0.1%～0.4%時，該菌均表現出一定的耐受力，且在6h時有增長的趨勢。由此可見，乳酸片球菌具有一定的抗膽鹽能力。

諾氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素、青霉素、利福平是目前臨床上常用的幾種抗生素。藥敏試驗證明乳酸片球菌對以上5種抗生素具有耐藥性。表明應用上述抗生素進行治療不會殺死小腸中的乳酸片球菌，推測這可能與該菌的細胞壁結構有關，有待于進一步研究。

綜合本試驗結果，PA003對單核細胞增多癥李氏桿菌等有明顯的抑制作用；50℃下可存活，80℃及以上耐熱能力顯著降低；在pH2.5、6h后活菌數從108CFU/mL降低到106CFU/mL，在pH3.5和4.5條件下，4h后表現出增長的趨勢；對膽鹽濃度0.1%-0.4%表現為較好的耐受性，高于0.4%生長較差；對諾氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素、青霉素、利福平有耐藥性。我們初步認為乳酸片球菌PA003是一株對腸道致病菌有抑制作用，耐酸、耐膽鹽、耐熱能力較強，對常用抗生素有一定耐藥性的優(yōu)良菌株，有作為人或動物益生菌的潛在應用前景。

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