天然促生因子促使黃漿水發酵條件優化

趙貴麗，羅愛平*，廖婭凡，吳紅滿，楊潔，宋志敏

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽 550025)

黃漿水主要來自熱豆漿凝固、制坯壓榨出來的泔水。黃漿水中含有豐富的營養物質及多種對人體健康有特殊功能作用的生理活性物質，如大豆異黃酮等[1-5]。但黃漿水中有機物含量低，培養所得生物量和產酸量有限，因此，需要加入一定量的營養物質以提高其生物量和產酸量[6]。面粉、糯米粉、大米粉、玉米粉不僅含有豐富的碳水化合物、蛋白質、脂肪等有機物，還含有礦物元素及維生素等營養物質，具有較高的營養價值，且來源廣泛，價格便宜，故利用這些天然促生因子與黃漿水有機結合、營養互補來滿足微生物的正常生長繁殖[7-10]。研究通過添加天然促生因子促使黃漿水自然發酵產酸。在單因素試驗的基礎上，選出最佳天然促生因子，采用均勻試驗設計優化發酵條件及最佳天然促生因子添加量，研制一種豆腐天然凝固劑。不僅滿足人們在飲食方面追求“綠色”、追求“天然”的理念，也減輕企業治污和推動社會效應，增加大豆加工附加值[11-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮黃漿水：將大豆進行精選、除雜、清洗后，用三倍于大豆（重量比）的自來水于室溫（25-28℃）下浸泡8-10h，瀝干后，用8倍于大豆干重的自來水于磨漿機進行磨漿，將所得豆漿用120目濾布進行過濾，并將濾出豆漿加熱至95℃，保持5min。待豆漿冷卻到80℃，量取1000mL熟豆漿于不銹鋼盆中，將盆放入80℃的恒溫水浴中，然后將30mL0.5M的氯化鎂溶液，緩慢加入熟豆漿中，并輕輕攪拌，直至豆漿凝固物出現停止攪拌，保溫靜置20min后破腦壓制得到的黃漿水；貴州中意食品有限責任公司提供。 面粉（80粉）、糯米粉、大米粉、玉米粉，購于貴陽市花溪區合力超市。 葡萄糖：購于保齡寶生物股份有限公司。氫氧化鈉等：分析純，重慶茂業化學試劑有限公司。

LRH系列生化培養箱 上海—恒科技有限公司；CS202B型電熱保溫干燥箱 重慶實驗設備廠；SZ-96型自動純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C酸度計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備 新鮮黃漿水中加入4 %（w/v）的葡萄糖，調整初始pH為 6.2，37 ℃自然發酵24 h，即為種子液，備用。1.2.2單因素試驗設計

1.2.2.1 天然促生因子的篩選 在黃漿水中分別添加4%（w/v）的面粉 、玉米粉 、糯米粉、大米粉，80 ℃水浴5min進行糊化，待冷卻后，調整初始pH 6.2，接種6%（v/v）種子液，37 ℃培養24 h，并以常用碳源葡萄糖及空白為對照，以產酸量和pH為考察指標，篩選最佳促黃漿水自然發酵的天然促生因子。

1.2.2.2 發酵條件的篩選 固定發酵溫度37℃、接種量6%（v/v）、最佳天然促生因子添加量4%（w/v）、發酵時間24h、培養基初始pH 6.2。在其它條件不變的前提下，分別改變發酵溫度27、30、34、37、42℃，接種量3%、6%、9%、12%、15%，最佳天然促生因子添加量0%、2%、4%、6%、8%、10%，發酵時間24、48、72、96、120h，以產酸量、pH為指標，考察四因素對黃漿水自然發酵的影響。

1.2.3 均勻試驗設計 根據單因素試驗結果，對黃漿水自然發酵條件進行優化。以發酵溫度（X1）、接種量（X2）、發酵時間（X3）、最佳天然促生因子添加量（X4）四個因素為自變量，以產酸量為Y，利用DPS軟件設計4因素5水平10個試驗處理的U10（54）均勻試驗[15-17]，因素水平見表1。

表1 U10（54）均勻設計因素及水平表Table 1 U10（54）Variables and levels in the uniform design

1.2.4 測定指標 產酸量的測定[18]:取5mL發酵液至250mL的三角瓶中，加入25 mL蒸餾水，再加2滴0.1%的酚酞，搖勻，用0.0l mol/L的NaOH標準溶液滴定至微紅色，30s不褪色即為終點。

式中：C- NaOH 標準溶液的濃度(mol/L)； V-滴定待測樣消耗 NaOH標準溶液的體積(mL)；V0-滴定原樣消耗的NaOH標準溶液的體積(mL)； m-取樣量(mL)； K-酸換算系數，用乳酸表示，K=0.090。

pH：采用PHS-3C酸度計測定。

1.2.5 數據處理 每個指標重復測定3次。采用統計分析軟件IBM SPSS Statistics v19.0.0進行顯著性分析。折線圖采用OriginPro 8.5繪圖軟件繪制。均勻試驗數據采用DPS軟件進行二次多項式逐步回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同天然促生因子對黃漿水自然發酵的影響

圖1 天然促生因子對黃漿水自然發酵的影響Fig. 1 The result of different natural growth-promoting factors to ferment yellow serofluid

圖1可知，空白組pH為4.01，葡萄糖組pH為3.58，面粉組pH為3.45，故在黃漿水中添加面粉時pH最低，即酸性最強。

黃漿水中添加面粉的產酸量最高為0.6251g/100mL，是葡萄糖組0.5742g/100mL的1.09倍，是空白組0.3042g/100mL的2.05倍。表明添加面粉能較好的促進黃漿水發酵產酸，產酸量顯著高于其余各組（p<0.05），故面粉為最佳天然促生因子。結果表明，黃漿水中添加面粉時產酸量最高，pH最低，且其來源廣泛，價格便宜，故面粉為最佳天然促生因子。

2.1.2 不同面粉添加量對黃漿水自然發酵的影響

圖2 面粉添加量對黃漿水自然發酵的影響Fig. 2 The result of different additive amount of flour to ferment yellow serofluid

由圖2可知，未添加面粉時，pH達最大值，產酸量達最小值；當面粉添加量為8%時，pH達到最低值，產酸量達最高值。

當面粉添加量由0升至2%時，產酸量顯著上升，表明添加面粉能夠促進黃漿水發酵產酸；面粉添加量為8%時，產酸量達到最大為0.7545g/100mL是未添加面粉組最小值0.3042g/100mL的2.48倍；當面粉添加量為8～10%時，產酸量呈下降趨勢，這是因為隨著面粉添加量增加，產酸菌生長速度加快，產酸量增加，使環境pH下降，抑制菌體的生長。同時當面粉添加量到一定濃度時，環境的滲透壓增加，使菌體生長受到抑制甚至不能忍受高滲環境死亡。結果表明：添加面粉對黃漿水發酵產酸影響顯著（p<0.05）；面粉添加量以8%為宜。

2.1.3 不同發酵溫度對黃漿水自然發酵的影響

圖3 發酵溫度對黃漿水自然發酵的影響Fig. 3 The result of different temperature to ferment yellow serofluid

由圖3可知，pH隨發酵溫度的升高呈先下降后上升趨勢；產酸量隨發酵溫度的升高呈先上升后下降趨勢。

當發酵溫度為 27～37℃時，產酸量隨發酵溫度的升高而升高；37℃時，產酸量達到最大值 0.6077 g/100mL，比27℃組最小值0.3507g/100mL提高73.28%，表明37℃適宜黃漿水自然發酵產酸，產酸量顯著高于其余各組（p<0.05）；當溫度由 37℃升至 42℃時，產酸量顯著降低，這是由于溫度過高，抑制產酸菌的生長所致。結果表明，37℃是黃漿水自然發酵產酸的最佳培養溫度。

2.1.4 不同發酵時間對黃漿水自然發酵的影響

圖4 發酵時間對黃漿水自然發酵的影響Fig. 4 The result of different time to ferment yellow serofluid

由圖4可知，當發酵時間由24h升至48h時，pH緩慢下降；當發酵時間為48h時，pH達到最低；當發酵時間為48～120 h，pH隨發酵時間的延長而顯著上升。

當發酵時間由24h延長至48h時，產酸量顯著上升；發酵時間為48 h時，產酸量達最大值0.7254g/100mL是120h組最小值0.1026g/100mL的7.07倍，顯著高于其余發酵時間組（p<0.05）；隨后產酸量隨發酵時間的延長而顯著降低，這是因為發酵后期腐敗菌導致產酸量下降所致，表明適宜發酵時間可以促進菌株發酵產酸。結果表明，黃漿水自然發酵時間以48h為宜。

2.1.5 不同接種量對黃漿水自然發酵的影響

圖5 接種量對黃漿水自然發酵的影響Fig. 5 The result of different inoculum size to ferment yellow serofluid

由圖5可知，接種量為3%～6%時，隨接種量的增加，黃漿水pH降低；接種量為6%時，pH達到最低為3.61；接種量為6%～15%時，隨接種量的增加pH升高；接種量為15%時，pH達到最高。

接種量由3%升至6%時，黃漿水產酸量緩慢升高；接種量為6%時，產酸量達到最高為0.5063g/100mL是最小值15%組0.2256g/100mL的2.24倍，表明黃漿水接種量為6%時適宜黃漿水發酵產酸，產酸量顯著高于其余各組（p<0.05）；接種量6%～15%，隨接種量的增加產酸量降低。結果表明，接種量以6%為宜。

2.2 均勻試驗結果與分析

由單因素結果可知，黃漿水中添加面粉時產酸量最高，pH最低，表明添加面粉能較好的促進黃漿水發酵產酸，并且面粉是最常見的食品原料之一，故選擇面粉為最佳天然促生因子。均勻設計U10（54）結果見表2。

表2 U10（54）均勻設計試驗結果Table 2 U10（54）The results of uniform design experiments

試驗結果經DPS軟件數據處理系統進行二次多項式逐步回歸分析，得回歸方程：Y=1.9441-0.0441X1-9.8839X2-0.0076X3+2.6791X4+0.0005X12+46.9041X22+0.00004X32+5.6626X42

根據相關系數R=94.89%,剩余標準差S=0.0927，表明該模型與實際試驗擬合程度很高，能很好的擬合黃漿水自然發酵條件。

經DPS軟件二次多項式逐步回歸，得出最高指標時各個因素組合為：X1=37.08，X2=0.03，X3=24.18，X4=0.075，即發酵溫度為37.08℃，接種量為3%(v/v)，發酵時間為24.18h，面粉添加量為7.5%(w/v)，此時產酸量得率最高為0.8537g/100mL。為便于生產應用，調整黃漿水自然發酵條件為發酵溫度37℃，接種量3%(v/v)，發酵時間 24h，面粉添加量 7.5%(w/v)。按照上述條件進行三次驗證試驗，得產酸量為0.8301g/100mL，達到回歸預測理論值（0.8537g/100mL）的97.24%，表明最佳發酵條件可靠。

3 討論與結論

3.1 由于制作豆腐時加工條件不同、使用凝固劑不同等原因，導致產生的黃漿水pH不盡相同。酸漿中主要是乳酸菌產酸，適宜乳酸菌生長的MRS培養基初始pH為6.2±0.2，故將黃漿水初始pH統一調整為6.2。

3.2 通過比較4種天然促生因子對黃漿水自然發酵產酸的研究，面粉為最佳天然促生因子。面粉添加量為4%時，其產酸量為0.6251g/100mL，是葡萄糖0.5742g/100mL的1.09倍，空白0.3042 g/100mL的2.05倍，表明添加面粉能較好的促進黃漿水發酵產酸。

3.3 將生物培養基中的常規碳源葡萄糖與天然促生因子碳源進行經濟性比較，表明面粉是一種來源廣泛，價廉物美，經濟性良好，能有效促使黃漿水自然發酵的天然促生因子。

3.4 均勻試驗優化黃漿水自然發酵產酸的最佳發酵條件為：發酵溫度37 ℃，接種量3%(v/v)，發酵時間24h,面粉添加量7.5%(w/v)，培養基初始pH 6.2，產酸量達0.8301g/100mL；比單一黃漿水自然發酵產酸量0.3042 g/100mL提高2.73倍，明顯提高了黃漿水自然發酵的產酸量。

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