響應面分析法優化核桃醬油的發酵條件

王曉楠，藺立杰，2，王豐俊，*

(1.北京林業大學食品科學與工程系，北京100083;2.煙臺大學環境與材料工程學院，山東煙臺264005)

醬油是我國傳統的釀造調味品，營養豐富且風味獨特，含有多種氨基酸、有機化合物和礦物質［1］。長期以來，釀造醬油是以大豆或者豆粕等植物蛋白為主要原料，以淀粉質原料為輔料，經米曲霉制曲、發酵釀制而成［2］。如何因地制宜，就地取材，綜合利用，來拓寬醬油生產蛋白質類原料的來源，成為當務之急。目前，已有利用花生餅、玉米渣、大米蛋白渣等生產醬油的報道，但利用核桃粕釀造醬油鮮有報道。核桃位居世界四大堅果之首［3］，具有很高的食用價值，在國內資源豐富，是傳統的食品加工原料［4－5］。核桃粕是核桃經過物理壓榨提取出大部分油脂后剩下的部分，蛋白含量可達到40%左右［6］，在核桃蛋白中含有18種氨基酸，有8種必需氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸含量較高［7］，而核桃蛋白制品品種較少，主要有核桃粉、濃縮蛋白、分離蛋白、蛋白肽等［8］。以榨油后的核桃粕為蛋白原料生產核桃醬油，蛋白含量充足且利用率很高［6］。既為核桃的綜合利用提供了廣闊的前景，有利于提高核桃粕附加值，又為生產營養醬油提供了方向。本研究在低鹽固態發酵基礎上以核桃粕代替大豆釀造醬油，控制發酵工藝、跟蹤檢測理化指標、探討發酵規律，進而優化工藝條件，為醬油釀造提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃粕 由河北晶品果業有限公司提供，油脂含量為32%;麩皮 購于北京本鄉面粉廠;滬釀3.042 北京林業大學微生物系提供;培養基 PDA培養基。

DHP－9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;LDZX－40AI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;B－260型恒溫水浴鍋上海亞榮生化儀器廠;KDY－9830凱氏定氮儀 北京瑞邦興業科技有限公司;95－1磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 原料→潤水→蒸煮→冷卻→接種→制曲→發酵→淋油→成品

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 種曲培養基［9］按照麩皮∶豆粕質量比為4∶1的比例在250mL三角瓶中加入20g過10目篩的干料，12g蒸餾水，拌勻。121℃，0.1MPa滅菌30min。

1.2.2.2 制曲 核桃粕、麩皮和面粉按55∶40∶5的比例混合，加入原料總重量115%的水混合拌勻，潤水20min后蒸料，在0.15MPa滅菌32min。熟料冷卻到40℃左右，按接種量0.5%(原料重量計)接入三角瓶菌種拌勻。制曲過程控制品溫28～32℃，最高不超過35℃，制曲時間在33h，待曲料疏松、孢子叢生、無夾生、無異味、無其他霉菌，具有正常曲香時，即為成曲［10］。

1.2.2.3 發酵 將成曲粉碎按照一定的比例加入鹽水混勻裝入發酵容器中，保溫發酵。鹽水濃度為12～13°Bé，發酵時間 7d左右。當醬醅呈紅褐色，有光澤，不發烏，醅層顏色一致，且柔軟，松散不黏，不干燥，無硬心，有醬香時，即為成熟醬醅［11］。醬醅在90℃下浸泡后淋油，經12h后取上清液得到生醬油，測其理化指標。

1.2.3 研究低鹽固態發酵條件的單因素實驗

1.2.3.1 鹽水原料比對氨基態氮含量的影響 在發酵工程中，鹽水和成曲的比例，即鹽水原料比對氨基酸的生成率有很大的影響，也影響發酵周期。在鹽水原料比為 1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1 條件下把成曲與鹽水混勻，將混合物置于發酵罐中，控制發酵溫度為45℃，發酵時間為6d，檢測不同鹽水原料比條件下醬油中氨基態氮的含量。

1.2.3.2 發酵溫度對氨基態氮含量的影響 以鹽水原料比為1.5的比例把成曲與鹽水混勻，將混合物置于發酵罐中，分別在 32、36、40、44、48℃溫度下發酵 6d，檢測不同發酵溫度條件下醬油中氨基態氮的含量。

1.2.3.3 發酵時間對氨基態氮含量的影響 以鹽水原料比為1.5的比例將成曲與鹽水混勻，將混合物置于發酵罐中，在45℃的發酵溫度，分別發酵2、4、6、8、10、12、14d，檢測不同發酵時間條件下醬油中氨基態氮的含量。

1.3 發酵工藝最優參數的確定

以氨基態氮含量為評價指標，依次進行鹽水原料比、發酵溫度、發酵時間的單因素實驗，并確定三因素三水平的最佳參數進行響應面分析。實驗設計的水平及編碼見表1。

表1 響應面實驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.4 測定方法

氨基態氮含量的測定:采用GB/T 5009.39－2003方法。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 鹽水原料比對氨基態氮含量的影響 鹽水原料比對氨基態氮含量的影響結果見圖1。從圖1可知，當鹽水原料比為1.5時，氨基態氮含量達到最大，隨著鹽水原料比進一步增加，氨基態氮含量大幅下降。食鹽能抑制雜菌生長，但也是各種酶活力的抑制劑，隨著食鹽含量的增加，會抑制酶的活力，減弱其對蛋白質的分解能力，致使氨基態氮含量下降。

圖1 鹽水原料比對氨基態氮含量的影響Fig.1 Influence of the ratio of brine and material on the formation of amino acid nitrogen

2.1.2 發酵溫度對氨基態氮含量的影響 發酵過程中控制鹽水原料比為1.5，發酵時間為6d，設置不同的發酵溫度，研究發酵溫度對氨基態氮含量的影響，結果見圖2。從圖2可以看出，在32～44℃之間氨基態氮含量平穩上升，到44～48℃之間大幅度下降。這是因為發酵過程中酶活力與溫度有一定的關系，酶有最適的作用溫度，如果溫度過高，酶結構遭到的破壞，酶活力下降，對蛋白質的分解減弱，進而影響氨基態氮含量。

圖2 發酵溫度對氨基態氮含量的影響Fig.2 Influence of fermentation temperature on the formation of amino acid nitrogen

2.1.3 發酵時間對氨基態氮含量的影響 發酵時間對氨基態氮含量的影響結果見圖3。如圖所示，氨基態氮含量隨著發酵時間的增加而增加，6d以后氨基態氮含量趨于穩定。發酵初期，醬醅中的蛋白質只是初步被酶解，而在第5d時大部分蛋白質已被酶解完成，直至8d時酶解基本完成，并趨于平衡。

2.2 響應面實驗結果與分析

2.2.1 響應面實驗設計及結果 根據Box－Behnken中心組合設計原理，在單因素實驗的基礎上，以鹽水原料比(A)、發酵溫度(B)、發酵時間(C)為實驗因素設計了3因素3水平的響應面分析實驗，實驗設計及結果見表2。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖3 發酵時間對氨基態氮含量的影響Fig.3 Influence of fermentation time on the formation of amino acid nitrogen

表2 Box－Behnken實驗設計及結果Table 2 Results of response surface experiments

通過 Design Expert軟件中的 Box－Behnken Design模型對表2數據進行二次響應面回歸分析，得到回歸方程為:Y=0.84+0.055A+0.044B－0.025C+0.015AB+6.000E－003AC+0.051BC－0.096A2－0.061B2－0.04C2對模型進行方差分析及回歸系數顯著性檢驗，結果見表3。

由表3回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著(p＜0.0001)，失擬項不顯著，并且該模型R2=0.9674，R2Adj=0.9306，說明該模型與實際實驗擬合較好［12］，能夠很好地反映響應值，可以用于核桃醬油發酵工藝實驗的預測。

通過表3 中:F(A)=42.83，F(B)=28.07，F(C)=9.28，可知各因素對發酵條件的影響程度大小順序為:鹽水原料比＞發酵溫度＞發酵時間。由顯著性檢驗結果得:回歸方程一次項A、B極顯著，C顯著;二次項A2、B2、C2極顯著;交互項除BC外，其他均不顯著。

2.2.2 響應面優化與分析 利用Design Expert 8.0.6軟件，作出各因素對氨基態氮含量的響應面分析圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析鹽水原料比、發酵時間、發酵溫度對氨基態氮含量的影響。通過圖4～圖6可知，鹽水原料比、發酵溫度、發酵時間與氨基態氮含量有顯著的相關性，表現為曲面較陡，其中鹽水原料比對氨基態氮含量影響最大。結合等高線的疏密程度可知［13］，發酵溫度與發酵時間的交互作用影響顯著，鹽水原料比與發酵溫度、鹽水原料比與發酵時間兩兩之間有一定的交互作用，但交互作用的影響不顯著。

2.2.3 發酵條件的優化與驗證 依據Design Expert軟件進行優化配置，得到最佳工藝條件為鹽水原料比1.65，發酵溫度45.51℃，發酵時間5.95d，氨基態氮含量的理論值為0.854g/100mL。考慮實際操作條件，將上述最佳發酵條件修正為鹽水原料比1.65，發酵溫度45℃，發酵時間6d。該條件下平行3次測氨基態氮含量均值為 0.835g/100mL，相對誤差為2.22%，說明該方程與實際情況擬合很好，具有一定的實踐指導意義。

圖4 鹽水原料比和發酵溫度對氨基態氮含量影響的響應面圖Fig.4 Response surface of brine－to－material ratio and fermentation temperature on the formation of amino acid nitrogen

圖5 鹽水原料比和發酵時間對氨基態氮含量影響的響應面圖Fig.5 Response surface of brine－to－material ratio and fermentation time on the formation of amino acid nitrogen

圖6 發酵溫度和發酵時間對氨基態氮含量影響的響應面圖Fig.6 Response surface of fermentation temperature and fermentation time on the formation of amino acid nitrogen

3 結論

在單因素的實驗基礎上，利用響應面法，結合回歸模型的數學分析，對核桃醬油低鹽固態發酵工藝進行了優化，進一步得到了最優工藝參數為:鹽水原料比1.65、發酵溫度45℃、發酵時間6d。在此工藝條件下，進行3次平行實驗測得氨基態氮含量達0.835g/100mL，相對誤差為2.22%。將核桃粕制曲生產核桃醬油，產品保持了核桃的營養特性，既拓寬了核桃粕的利用價值，又為消費者提供了新型的健康調味品。

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