冰島刺參巖藻糖基化硫酸軟骨素降血糖及改善胰島素抵抗的研究a

田迎櫻，胡世偉，薛長湖，李兆杰,*

（1青島工學院食品工程學院 青島 266003；2中國海洋大學食品科學與工程學院 青島266003）

2型糖尿病患者占糖尿病患者總數的90%以上，目前認為，胰島素抵抗是其主要的始發因素[1]。胰島素抵抗是2型糖尿病的顯著特征之一及最好的預測因子，因此，提高胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗已成為防治2型糖尿病及其并發癥的重要手段[2]。

海參巖藻糖基化的硫酸軟骨素（fucosylated chondroitin sulfate from sea cucumber,SC-CHS）是1種帶有類巖藻糖支鏈的酸性黏多糖，且糖鏈上有部分羥基發生硫酸酯化。目前對SC-CHS活性的研究主要集中在抗凝血[3]、抗血栓[4]、抗腫瘤[5]等生物活性，其降血糖作用及改善胰島素抵抗的的作用尚未見報道。冰島刺參是1種低經濟價值的海參，主要分布在大西洋北部，其產量大、營養價值較高、利用率較低。本文以冰島刺參中巖藻糖基化的硫酸軟骨素（fucosylated chondroitin sulfate from Cucumaria frondosa, Cf-CHS）為研究對象，研究其對2型糖尿病小鼠降血糖及對胰島素抵抗的改善作用，為低值海參的高值化利用提供理論依據。

1 材料方法

1.1 材料與儀器

♂ C57BL/6J小鼠，SPF級，體質量17-19g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2009-0007。冰島刺參購自青島市南山水產品市場，由中國科學院海洋研究所廖玉麟研究員對其進行了種屬鑒定。

干酪素、氯化膽堿、DL-蛋氨酸、氯化十六烷基吡啶（CPC）、羅格列酮、木瓜蛋白酶（5327U/mg）購自美國Sigma公司；葡萄糖測定試劑盒，購自北京中生北控生物科技股份有限公司；胰島素、脂聯素、抵抗素、瘦素和TNF-α ELISA檢測試劑盒，購自美國R&D公司；其它試劑均為國產分析純。

GL-20M型高速冷凍離心機，上海盧湘離心機儀器有限公司產品；TDD5K型冷凍離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司產品；Model680型酶標儀，美國Bio RAD產品； ALPHA 1-4 LO型凍干機，德國CHRIST公司產品；LABOROTA 4 000型旋轉蒸發儀，德國Heidolph產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖藻糖基化的海參硫酸軟骨素制備

按照文獻方法提取Cf-CHS[3]。將冰島刺參干品粉碎，丙酮浸泡脫脂24h，晾干。向脫脂干海參中（以下提取步驟均按照1g 干物計算）加入木瓜蛋白酶100mg， 60℃水浴24h，上清液中加入1.6mL 10%的CPC溶液，室溫下4000r/min離心15min。沉淀溶解于15mL 3mol·L-1NaCl∶乙醇（100∶15體積分數）溶液中，分兩步使溶液醇度達到40%及75%，分別按上述離心，取乙醇濃度為75%的離心沉淀物，分別用30mL 80%和 95%乙醇先后洗2～3次。蒸餾水溶解沉淀物，用截流分子量為10,000u的透析袋室溫下蒸餾水透析48h，每12h換水，濃縮，凍干，得粗Cf-CHS，檢測純Cf-CHS在粗品中的含量為85-90%。粗多糖過DEAE-52陰離子交換柱，以0～1.4mol·L-1NaCl連續梯度緩沖鹽溶液進行洗脫，每7mL收集1管。洗脫液過液相TSK4 000柱子，檢測組分單一的管，收集后透析，真空冷凍干燥，得Cf-CHS純品。本課題組前期研究顯示，Cf-CHS分子量為21.53ku，得率為4.03%，主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和海藻糖組成，且3種糖摩爾比為1∶1.14∶1.55[6]，其硫酸根含量占總糖的27.81%[7]。

1.2.2 動物分組及實驗

用飼喂高脂高糖飼料的方法建立胰島素抵抗小鼠模型。C57BL/6小鼠隨機分為正常對照（標準飼料）、模型對照（HFSD）、陽性對照（HFSD+rosiglitazone (RSG), 1mg·(kg·d)-1）、Cf-CHS 組（HFSD+Cf-CHS, 80mg·(kg·d)-1）及 Cf-CHS+RSG 組（HFSD+Cf-CHS+RSG，80+1mg·(kg·d)-1）。各組動物飼料配制成分見表1。其中，復合礦物質及維生素均參照AIN-93配方。按照阿特沃特通用系數系統進行食物能量換算，正常組飼料熱量為3.85 kcal·g-1，其它組飼料熱量為4.85kcal·g-1。

小鼠自由攝食和飲水，每3d記錄體質量及食量，連續喂養19周。末次喂養后，禁食不禁水 10h，摘眼球取血，常規分離血清，保存于-20℃備用。迅速剝離皮下脂肪、腎周脂肪、附睪脂肪，稱重。

表1 動物飼料配方組成/g·kg-1Table 1 Compositions of animals’ experimental diets/g·kg-1

1.2.3 空腹血糖及葡萄糖耐量測定

小鼠禁食不禁水 5h，尾靜脈取血，參照試劑盒方法測定空腹血糖水平。小鼠灌胃葡萄糖溶液（2g·kg-1），分別測定給葡萄糖后0、0.5和2h的血糖值，按式1計算血糖濃度-時間曲線下面積（area under the curve, AUC）：

1.2.4 血清胰島素測定

小鼠禁食不禁水10h，摘眼球取血，常規分離血清，參照ELISA試劑盒方法測定，并按式2計算胰島素抵抗指數（insulin resistance index, HOMA-IR）：

1.2.5 血清脂聯素、抵抗素、瘦素及TNF-α測定

參照ELISA試劑盒方法測定。

1.3 數據統計處理

2 結果與分析

2.1 對小鼠體質量增量的影響

肥胖是2型糖尿病的重要誘發因素。60%以上的成年2型糖尿病患者在發病前存在肥胖，且肥胖程度與糖尿病的發病率成正相關。如表 2所示，模型對照組小鼠體質量增量明顯高于正常對照組（p<0.01），而攝食量變化不顯著。與模型對照組相比，Cf-CHS組和Cf-CHS+RSG小鼠體質量增量分別顯著降低了14.16%和32.24%。與陽性對照組相比，Cf-CHS+RSG組小鼠體質量增量降低了10.20%。結果表明，Cf-CHS可以抑制小鼠體質量的增加，Cf-CHS與RSG復配使用，效果更佳。

表2 Cf-CHS對胰島素抵抗小鼠體重增量及脂肪重量的影響（n=10, ±s）Table 2 Effects of Cf-CHS on body weight gain and adipose weight in type insulin resistant mice（n=10,±s）

表2 Cf-CHS對胰島素抵抗小鼠體重增量及脂肪重量的影響（n=10, ±s）Table 2 Effects of Cf-CHS on body weight gain and adipose weight in type insulin resistant mice（n=10,±s）

注：##p<0.01 與正常組比; * p<0.05, ** p<0.01 與模型組比; ★p<0.05與陽性組比。Note: ## p<0.01 vs normal control; * p<0.05, ** p<0.01 vs model control; ★p<0.05 vs positive control group.

組別 攝入食量/g·d-1 體重增量/g 腎周脂肪/g 附睪脂肪/g 皮下脂肪/g 白色脂肪/g 體脂比/%正常對照 4.10±0.08 11.83±0.77 0.23±0.04 0.50±0.14 0.10±0.07 0.78±0.10 2.69±0.23模型對照 3.49±0.24 24.49±1.77 ## 0.62±0.12 ## 1.67±0.19 ## 0.54±0.08 ## 2.86±0.24 ## 6.98±0.64 ##陽性對照 3.43±0.20 18.43±0.86 ** 0.37±0.08** 0.90±0.16** 0.36±0.11* 1.50±0.16** 4.20±0.32**Cf-CHS 3.45±0.23 21.02±1.03 * 0.42±0.15* 1.14±0.11** 0.41±0.07* 1.91±0.17** 4.51±0.44**Cf-CHS+RSG 3.39±0.14 16.55±0.78 **★ 0.29±0.09**★ 0.54±0.10**★ 0.28±0.08** 1.02±0.17**★ 3.10±0.34**★

2.2 對脂肪積累的影響

如表2所示，模型對照組小鼠體內白色脂肪重量和體脂比顯著高于正常對照組（p<0.01），說明高脂高糖飲食導致了脂肪的積累。攝食Cf-CHS后，與模型對照組比，Cf-CHS組小鼠白色脂肪重量和體脂比降低了33.22%和35.39%；與陽性對照組比，Cf-CHS+RSG組小鼠白色脂肪重量和體脂比顯著降低（p<0.05）。結果提示 Cf-CHS能減少脂肪在體內的積累，且Cf-CHS與RSG復配使用優于Cf-CHS單用。

2.3 對空腹血糖及糖耐的影響

空腹血糖和葡萄糖耐受性是目前公認診斷糖尿病的標準。葡萄糖耐受性與AUC成反比。如表3及圖1所示，模型對照組小鼠空腹血糖和AUC較正常對照組顯著升高（p<0.01），表明模型對照組小鼠出現了高血糖癥狀，且糖耐水平已經受損。攝食Cf-CHS后，與模型對照組比，Cf-CHS組小鼠空腹血糖和AUC積顯著下降了15.55%和13.87%；與陽性對照組比，Cf-CHS+RSG組小鼠 AUC顯著下降了 11.70%，而空腹血糖水平變化不顯著。結果提示Cf-CHS有一定的降血糖作用，且與RSG復配后效果更顯著。

表3 Cf-CHS對胰島素抵抗小鼠空腹血糖、血清胰島素水平及胰島素抵抗系數的影響（n=10, ±s）Table 3 Effects of Cf-CHS on fasting blood glucose and serum insulin levels in insulin resistant mice（n=10,±s）

表3 Cf-CHS對胰島素抵抗小鼠空腹血糖、血清胰島素水平及胰島素抵抗系數的影響（n=10, ±s）Table 3 Effects of Cf-CHS on fasting blood glucose and serum insulin levels in insulin resistant mice（n=10,±s）

注：## p<0.01 與正常組比; * p<0.05, ** p<0.01 與模型組比; ★p<0.05與陽性組比。Note: ##p<0.01 vs normal control; *p<0.05, **p<0.01 vs model control; ★p<0.05 vs positive control group.

組別 空腹血糖/ mmol·L-1 血清胰島素/ mU·L-1 HOMA-IR正常對照 9.28±1.40 10.82±0.32 4.53±0.31模型對照 13.12±0.82## 14.68±0.60## 8.22±0.95##陽性對照 10.92±0.69** 13.36±0.14* 5.79±2.62*Cf-CHS 11.08±0.85* 13.54±0.57* 5.66±2.05*Cf-CHS+RSG 10.14±0.67** 11.29±0.66**★ 4.93±1.55**

圖1 Cf-CHS對胰島素抵抗小鼠葡萄糖耐受量的影響（n=10,±s）## p<0.01 與正常組比; * p<0.05, ** p<0.01 與模型組比; ★p<0.05 與陽性組比.Fig.1 Effects of Cf-CHS on glucose tolerance in insulin resistant mice（n=10,±s）## p<0.01 vs normal control; * p<0.05, ** p<0.01 vs model control; ★p<0.05 vs positive control group.

2.4 對血清胰島素水平的影響

高血糖和胰島素抵抗是2型糖尿病的標志。在2型糖尿病早期，胰島素水平越高，說明胰島素抵抗程度越嚴重。HOMA-IR是用于評價個體的胰島素抵抗水平的指標。由表3可知，高脂高糖飲食顯著提高了模型對照組小鼠血清胰島素水平和 HOMA-IR值（p<0.01），說明模型對照組出現了嚴重的胰島素抵抗病變。與模型對照組比，Cf-CHS組小鼠血清胰島素含量和HOMA-IR值分別降低了7.77%和31.14%；與陽性對照組相比，Cf-CHS+RSG組小鼠血清胰島素水平顯著降低了15.49%，而HOMA-IR值變化不顯著。結果提示Cf-CHS能改善小鼠的胰島素抵抗，與RSG復配后效果更顯著。

2.5 對脂聯素的影響

脂聯素是脂肪細胞特異性分泌的蛋白質，血清脂聯素濃度與胰島素敏感性呈正相關，與機體胰島素抵抗程度呈負相關。由表 4可知，與正常對照組比，模型組小鼠的血清脂聯素水平顯著降低（p<0.01）。經Cf-CHS干預后，與模型對照組比，Cf-CHS組脂聯素水平提高了22.81%；與陽性對照組比，Cf-CHS+RSG組脂聯素變化不顯著。提示Cf-CHS能促進脂肪組織分泌脂聯素，改善胰島素抵抗。

表4 Cf-CHS對胰島素抵抗小鼠血清脂聯素、抵抗素、瘦素及TNF-α含量的影響（n=10, ±s）Table 4 Effects of Cf-CHS on serum adiponectin, resistin, leptin, and TNF-α levels in insulin resistant mice（n=10，±s）

表4 Cf-CHS對胰島素抵抗小鼠血清脂聯素、抵抗素、瘦素及TNF-α含量的影響（n=10, ±s）Table 4 Effects of Cf-CHS on serum adiponectin, resistin, leptin, and TNF-α levels in insulin resistant mice（n=10，±s）

注：## p<0.01 與正常組比; * p<0.05, ** p<0.01 與模型組比; ★p<0.05, ★★p<0.01與陽性組比。Note: ## p<0.01 vs normal control; * p<0.05, ** p<0.01 vs model control; ★p<0.05, ★★p<0.01 vs positive control group.

組別 脂聯素/ng·mL-1 抵抗素/ng·mL-1 瘦素/ng·mL-1 TNF-α/pg·mL-1正常對照 205.40±9.73 5.57±0.10 0.147±0.007 57.03±1.37模型對照 110.20±18.08## 11.59±0.60## 0.316±0.026## 100.78±6.53##陽性對照 151.78±7.27** 8.43±0.18** 0.218±0.036* 77.40±3.15**Cf-CHS 135.34±9.67* 8.43±0.42** 0.192±0.025** 76.42±2.10*Cf-CHS+RSG 164.14±5.13** 7.07±0.51**★ 0.140±0.011**★★ 60.41±2.09**★

2.6 對抵抗素的影響

抵抗素是由脂肪細胞產生和分泌的特異性肽激素，作用于骨骼肌細胞、脂肪細胞等，能降低其對胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗。由表4可知，經Cf-CHS干預后，與模型對照組比，Cf-CHS組小鼠抵抗素含量顯著降低了27.26%；與陽性對照組比，Cf-CHS+RSG組小鼠抵抗素含量顯著降低（p<0.05）。提示，Cf-CHS能降低脂肪細胞分泌抵抗素的能力，改善胰島素抵抗，與RSG復配后效果更顯著。

2.7 對瘦素的影響

瘦素主要是由白色脂肪組織分泌的特異性蛋白質，能免抑制脂肪的合成，與胰島素抵抗程度呈正相關。由表4可知，經Cf-CHS干預后，與模型對照組比，Cf-CHS組瘦素含量顯著降低了39.24%；與陽性對照組比，Cf-CHS+RSG組小鼠瘦素含量顯著降低（p<0.01）。提示Cf-CHS能抑制脂肪細胞對瘦素的合成，抑制胰島素抵抗，與RSG復配后效果更顯著。

2.8 對TNF-α 的影響

TNF-α能夠抑制脂肪細胞合成，促進脂肪細胞分解，誘導產生瘦素，與胰島素抵抗呈正相關。由表 4可知，飼喂Cf-CHS后，與模型對照組比，Cf-CHS組小鼠血清TNF-α水平顯著降低了24.17%；與陽性對照組比，Cf-CHS+RSG組小鼠TNF-α含量顯著降低（p<0.05）。提示Cf-CHS能抑制巨噬細胞產生TNF-α，改善胰島素抵抗，且Cf-CHS能增強陽性藥物RSG的作用。

3 討論

本實驗采用高脂高糖建立了胰島素抵抗小鼠模型，研究了Cf-CHS降血糖及改善胰島素抵抗作用。結果顯示，Cf-CHS能顯著減輕小鼠體質量及體脂比，降低空腹血糖水平，改善糖耐受損，抑制胰島素抵抗，增加血清脂聯素含量，降低血清抵抗素、瘦素和TNF-α含量。Cf-CHS與RSG復配后，除脂聯素外，上述作用更顯著。結果提示，Cf-CHS能改善2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗，且Cf-CHS與RSG具有協同作用。

近年來研究發現，脂肪組織具有分泌多種細胞因子的功能，可以調節糖脂代謝、胰島素敏感性，參與糖尿病及相關疾病的發生發展。其中，脂聯素、抵抗素、瘦素和 TNF-α等是與胰島素抵抗相關的脂肪細胞因子。脂肪細胞對上述分泌產物過多或不足能夠引起胰島素抵抗。脂聯素是與胰島素抵抗程度呈負相關的細胞因子，在2型糖尿病患者體內低表達，其濃度隨脂肪體積的增大而減少，作用機制可能與PI3K胰島素信號通路的缺陷有關[8]。魏學娟等證明黃芪多糖能通過提高胰島素抵抗大鼠血清脂聯素含量起到增加胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗[9]。本實驗中Cf-CHS顯著提高了小鼠血清脂聯素水平，降低了胰島素抵抗程度。抵抗素、瘦素和TNF-α是與胰島素抵抗程度正相關的脂肪細胞因子，在2型糖尿病患者體內高表達。高水平的抵抗素可以抑制胰島素的分泌和功能，誘導產生高胰島素血癥并增強胰島素抵抗。Sang WK 等發現銀耳多糖能降低db/db小鼠血清抵抗素水平，促進其基因和蛋白的表達[10]。瘦素不僅能削弱胰島素的生物效應，而且能通過抑制脂肪分解降低肌肉對胰島素的敏感性，從而出現胰島素抵抗，另一方面，瘦素對胰島素的分泌及其敏感性產生負反饋調節。金智生等證明紅芪多糖能降低高脂高糖誘導的胰島素抵抗大鼠的血清及脂肪中瘦素的含量，改善胰島素抵抗[11]。TNF-a與血清胰島素水平、葡萄糖代謝及脂質代謝密切相關，高水平的TNF-a能抑制胰島素的功能，誘導高胰島素血癥。Ji-Hye K等發現辣椒素能降低2型糖尿病小鼠脂肪組織中TNF-α表達，提高胰島素敏感性并改善胰島素抵抗[12]。本實驗中Cf-CHS顯著降低了2型糧尿病小鼠的血清抵抗素、瘦素和TNF-α含量，改善了胰島素抵抗；Cf-CHS與RSG復配使血清抵抗素、瘦素和TNF-α的濃度降低更顯著。提示Cf-CHS能通過增加血清脂聯素濃度及降低血清抵抗素、瘦素和TNF-α的水平，改善胰島素抵抗。

RSG是1種噻烷二唑酮類降血糖藥物，是1類選擇性PPAR-γ配體，作為一類胰島素敏感劑發揮作用[13]。RSG降血糖及改善胰島素抵抗的活性已有廣泛的報道[14]，然而也伴隨有一系列的副作用[15]。在美國及歐洲，RSG的使用已量顯著減少，且被建議避免單獨用于 2型糖尿病和胰島素抵抗的治療[16]。周燕等證明羅格列酮能降低胰島素抵抗個體中血清和脂肪組織中抵抗素和瘦素含量[17]。鄧宏明等證明羅格列酮增加胰島素抵抗患者血清脂聯素水平，并降低TNF-α水平[18]。本實驗中，與陽性對照組相比，Cf-CHS與RSG復配使用進一步顯著降低了血糖水平，改善了小鼠的胰島素抵抗及調節血清中脂肪細胞因子的水平。說明Cf-CHS與RSG具有協同效應，能進一步降低胰島素抵抗程度。提示對胰島素抵抗的治療，可以通過攝入Cf-CHS降低RSG的用量。

綜上所述，Cf-CHS能通過促進脂肪細胞對脂聯素的分泌，抑制抵抗素、瘦素和TNF-α的分泌，改善胰島素抵抗。其進一步作用機制尚待深入研究。

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