牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠免疫功能及抗氧化能力的影響

俞浩，張孝林，毛斌斌，路方方

（安徽科技學院 食品藥品學院，安徽 蚌埠233100）

牯嶺勾兒茶（Berchemia kulingensis Schneid）為鼠李科勾兒茶屬植物，分布于安徽、江蘇、浙江等省，生于山谷灌叢、林緣或林中。自古以來，安徽滁州一帶百姓采其葉芽炒制加工為茶，習稱“藤茶”，長期飲用具有保肝養顏、降壓降脂等功效。我國勾兒茶屬植物有18種，6變種，主要集中于西南、華南、中南及華東地區，本屬大部分植物的根、莖或葉均可藥用，具有祛風利濕、活血止痛、止咳祛痰功效，主要用于治療風濕性關節炎、氣管炎、肺結核、黃疸、癰腫瘡毒、跌打損傷等癥。化學成分及藥理作用研究表明，勾兒茶屬植物中含有黃酮類、木脂素類、苷類、黃酮和多糖等成分，從該屬植物中分離得到二聚體化合物具有保肝、抑菌、止咳平喘、抗組胺、抑酶等多種生物活性[1]。植物多糖具有抗腫瘤、增強機體免疫功能、抗氧化、調節血糖血脂、抗病毒等多種藥理活性，且毒副作用低，因此，有關植物多糖的研究和開發應用較為廣泛[2]。但當前有關牯嶺勾兒茶及其成分生物活性的研究尚未見文獻報道。本研究以自然衰老小鼠為研究對象，觀察牯嶺勾兒茶多糖對其免疫功能及抗氧化能力的影響，以期為牯嶺勾兒茶資源的開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠（體質量 42±2g） 雌雄各半，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為：SCXK(皖)2007-001，實驗室飼養至19月齡供試驗用；牯嶺勾兒茶多糖 安徽科技學院中藥及藥物制劑實驗室制備（水提醇沉法制備，sevage法脫蛋白，硫酸-苯酚顯色法測定多糖質量分數為 78.32%），將多糖水解、乙酰化后，氣質聯用分析結果顯示，牯嶺勾兒茶多糖主要含D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖組成，質量分數分別為36.4%、16.3%、25.6%、14.7%；玉屏風顆粒 廣東環球制藥有限公司，批號130316；中華墨水 上海精細文化用品有限公司，批號：120301，臨用時用生理鹽水稀釋 5倍；IgG、IgM、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒 均購自南京建成生物工程研究所。

FA2104B電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TG16-WS臺式高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；Multiskan FC型酶標儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠炭粒廓清功能及免疫器官指數的影響 取小鼠50 只，雌雄各半，隨機分為牯嶺勾兒茶多糖高、中、低劑量組（劑量分別為 40、20、10mg/kg，給藥時用生理鹽水配制至所需濃度），玉屏風顆粒組（劑量為5.0g/kg）和正常對照組。灌胃給藥，給藥容積為0.2mL/10g體重，每日1次，連續7d，正常對照組給等容積的生理鹽水。末次給藥后30min，小鼠稱重，然后經尾靜脈注射中華墨水0.1mL/10g體重，分別于注射后2、10min小鼠眼眶后靜脈叢采血20μL，立即加入2mL 0.1% Na2CO3溶液中，采用分光光度計在680nm 處測定OD值。另取未注射墨汁正常小鼠血20μL加入2mL 0.1% Na2CO3溶液作空白對照。處死動物，摘取肝臟、脾臟和胸腺，稱重。計算廓清指數K 值和吞噬指數α，K=(logA1-logA2)/(t2-t1)，其中A1、A2分別代表采血樣測得的吸光度，t2、t1分別代表兩次采血的時間間隔；α= K1/3×體重/(肝重+脾重)。計算脾臟指數和胸腺指數。胸腺指數（mg/g）=胸腺重量/小鼠體重，脾臟指數（mg/g）=脾臟重量/小鼠體重[3-4]。

1.2.2 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清免疫球蛋白水平的影響 分組及給藥同“1.2.1”。末次給藥后 30min，小鼠稱重，摘眼球取血，離心分離血清，備用[5]。取血清，按試劑盒說明書操作方法，ELISA法測定血清中IgG、IgM含量。

1.2.3 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清及肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

分組及給藥同“1.2.1”。末次給藥后30min，摘眼球取血，3600r/min離心分離血清，冰箱保存備用。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸盡水分，剪取部分肝臟，電子天平稱重后置玻璃勻漿器中，按質量體積比 1:9 加生理鹽水勻漿，勻漿液 3600r/min 離心 15min，取上清，待測[6-8]。按試劑盒說明書操作方法測定小鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.3 數據處理與統計方法

2 結果與分析

2.1 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠炭粒廓清功能的影響

碳粒廓清指數是反映機體非特異性免疫功能的重要指標，隨著年齡的增加，巨噬細胞的吞噬功能降低，碳粒廓清功能下降。本實驗結果表明，牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠碳粒廓清指數和吞噬指數顯著提高，與正常對照組比較具有極顯著差異（p＜0.01），說明牯嶺勾兒茶多糖能夠提高老齡小鼠的非特異性免疫功能。結果見表1。

表1 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠炭粒廓清功能的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on carbon clearance function in aged mice(±s，n=10)

表1 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠炭粒廓清功能的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on carbon clearance function in aged mice(±s，n=10)

注：與正常對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01。表2-表5同。

組別 劑量（g/kg） 廓清指數（K）×102 吞噬指數（α）正常對照組 — 2.97±0.52 6.17±0.37玉屏風顆粒組 5.0 3.77±0.63** 6.69±0.36**牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 3.85±0.58** 6.74±0.34**牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 3.50±0.82 6.51±0.49牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 3.34±0.71 6.41±0.47

2.2 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠免疫器官指數的影響

隨著年齡的增長，免疫器官老化、萎縮，機體的免疫功能逐漸減弱。與正常對照組比較，牯嶺勾兒茶多糖高、中劑量組小鼠脾臟指數顯著增加，差異具有顯著性意義（p＜0.05或p＜0.01）；與正常對照組比較，牯嶺勾兒茶多糖高、中、低劑量組小鼠胸腺指數亦顯著增加，差異具有顯著性意義（p＜0.05或p＜0.01）。結果表明牯嶺勾兒茶多糖能抑制衰老引起的脾臟和胸腺的萎縮，且其作用呈劑量依賴關系。結果見表2。

表2 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠免疫器官指數的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on immune organ index in aged mice(±s，n=10)

表2 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠免疫器官指數的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on immune organ index in aged mice(±s，n=10)

組別 劑量/（g/kg） 脾臟指數（mg/g體重） 胸腺指數（mg/g體重）正常對照組 — 5.09±0.84 3.26±0.70玉屏風顆粒組 5.0 6.53±0.98** 4.67±1.26**牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 6.34±0.94** 4.52±1.10**牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 6.19±1.14* 4.70±0.88**牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 5.13±1.09 4.19±0.93*

2.3 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清免疫球蛋白水平的影響

衰老小鼠血清中免疫球蛋白水平下降。與正常對照組比較，牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠血清 IgG、IgM水平顯著升高，差異具有顯著性意義（p＜0.01），說明牯嶺勾兒茶多糖能提高老齡小鼠血清免疫球蛋白水平。牯嶺勾兒茶多糖中、低劑量組小鼠血清 IgG、IgM 水平有升高趨勢，但與正常對照組比較無顯著性差異（p＞0.05）。結果見表3。

表3 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清免疫球蛋白水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on serum immune globulin in aged mice(±s，n=10)

表3 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清免疫球蛋白水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on serum immune globulin in aged mice(±s，n=10)

組別 劑量（g/kg） IgG（mg/L） IgM（mg/L）正常對照組 — 249.61±22.16 78.6±24.83

玉屏風顆粒組 5.0 298.31±32.24** 121.11±38.61牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 286.46±29.74** 113.27±21.69**牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 270.26±42.59 94.27±33.48牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 266.37±23.34 89.63±31.27

2.4 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

隨著機體的衰老，體內抗氧化酶活性下降，過氧化產物生成增多，自由基生成和消除失衡，氧自由基的大量積聚，造成組織細胞的過氧化損傷。牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高，與正常對照組比較具有顯著性差異（p＜0.05）；牯嶺勾兒茶多糖高、中劑量組小鼠血清GSH-Px活性顯著升高，與正常對照組比較具有顯著性差異（p＜0.05 或p＜0.01）；牯嶺勾兒茶多糖高、中劑量組小鼠血清MDA含量顯著下降，與正常對照組比較具有極顯著性差異（p＜0.01）。說明牯嶺勾兒茶多糖具有抗過氧化損傷作用。結果見表4。

表4 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in serum in aged mice(±s，n=10)

表4 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in serum in aged mice(±s，n=10)

組別 劑量/（g/kg） SOD/（nU/mL） GSH-Px/（nU/mL） MDA/（nmol/mL）正常對照組 — 194.71±27.82 26.09±5.07 10.17±2.11玉屏風顆粒組 5.0 247.50±35.77** 36.00±5.42** 7.26±2.99**牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 239.65±41.90* 35.38±5.31** 6.34±1.73**牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 227.60±42.98 31.43±4.06* 7.26±1.44**牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 207.15±46.85 29.68±6.92 8.33±2.30

2.5 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

與正常對照組比較，牯嶺勾兒茶多糖高、中劑量組小鼠肝臟SOD活性顯著升高，差異具有顯著性意義（p＜0.01或p＜0.05）；牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠肝臟GSH-Px活性顯著升高，與正常對照組比較具有顯著性差異（p＜0.05）；牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠血清MDA含量顯著下降，與正常對照組比較具有顯著性差異（p＜0.05）。說明牯嶺勾兒茶多糖具有抗肝臟脂質過氧化損傷作用。結果見表5。

表5 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響( ±s，n=10)Table 5 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in liver in aged mice(±s，n=10)

表5 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響( ±s，n=10)Table 5 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in liver in aged mice(±s，n=10)

組別 劑量/（g/kg） SOD（nu /mg pro） GSH-Px（U /mg pro） MDA（nmol /mg pro）正常對照組 — 108.91±26.03 31.20±8.67 21.82±4.68玉屏風顆粒組 5.0 141.81±20.97** 39.75±6.30** 17.27±2.61*牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 138.82±16.84** 38.58±4.69* 17.36±2.88*牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 131.89±14.78* 34.86±5.58 18.85±3.78

牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 118.41±31.07 33.13±4.50 19.89±5.53

3 結論

衰老機制復雜，其中免疫學理論和自由基理論在眾多理論中占有重要地位[9-10]。本研究從免疫學和自由基的角度探討牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠的免疫功能和抗氧化作用的影響。

玉屏風散為中醫臨床常用方劑，可斂汗固表，被稱為中藥免疫調節劑。研究表明，玉屏風散能顯著提高正常小鼠的胸腺和脾臟指數, 促進溶血素生成和溶血空斑的形成, 促進淋巴細胞轉化，升高小鼠血清和肝組織中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，具有顯著免疫促進和抗氧化作用[11-12]。本實驗結果亦證實，玉屏風散具有顯著的提高免疫功能和抗氧化作用。因此，本研究選用玉屏風散作為陽性對照藥物。

衰老的免疫學理論認為，免疫系統參與衰老過程，隨著年齡的增長，免疫器官老化、萎縮，免疫細胞和細胞因子發生變化，機體的免疫功能逐漸減弱。胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，胸腺指數和脾臟指數是衡量機體非特異性功能的重要指標。胸腺為中樞免疫器官，其能誘導胸腺細胞分化成熟為功能不同的T細胞亞群，是T細胞發育、分化和成熟的場所，成熟的T細胞經血液或淋巴液轉移至外周免疫器官，接受抗原刺激，產生免疫應答，發揮免疫效應；同時胸腺還能誘導胸腺細胞對自身抗原形成免疫耐受[13]。脾臟為外周免疫器官，是人體最大的免疫器官，是具有免疫活性的T、B 細胞移居和接受抗原刺激后產生免疫應答的重要場所[14]。IgG主要由脾臟、淋巴結和骨髓中的漿細胞合成，是再次體液免疫應答產生的全身性體液免疫反應的效應因子，在血液中含量最高，在機體防御中主要發揮發揮抗菌、抗病毒和中和毒素等作用，其含量在一定程度上反映了對機體體液免疫的調節功能。IgM是最早出現的免疫球蛋白，也是一級免疫應答中所產生的主要免疫球蛋白，也產生于二級免疫應答，其生成數量較少，但在激活補體、調理作用、中和病毒和凝集作用等方面比IgG更有效[15]。本實驗研究結果表明，牯嶺勾兒茶多糖能明顯提高老齡小鼠碳粒廓清指數和吞噬指數，增加胸腺指數和脾臟指數，提高血清中IgG和IgM水平，說明牯嶺勾兒茶多糖能夠增強老齡小鼠的免疫功能。

衰老的自由基理論認為，隨著年齡的增加，機體的抗氧化酶活性下降，過氧化產物增多，自由基生成和消除失衡，氧自由基的大量積聚使細胞膜上的脂肪酸生成過氧化物，進一步生成脂褐素，造成核酸、蛋白質損傷，產生過氧化損傷。SOD和GSH-Px是機體的主要抗氧化酶，其中SOD能催化氧自由基發生歧化反應，生成H2O2，GSH-Px能迅速清除H2O2，兩者共同發揮作用使組織細胞免受過氧化損傷。MDA為生物膜不飽和脂肪酸-花生四烯酸的過氧化產物，是衡量體內自由基代謝情況的重要指標，能夠客觀反映體內的自由基的水平[16]。本實驗研究結果顯示，牯嶺勾兒茶多糖能升高血清和肝臟中SOD、GSH-Px活性，降低血清和肝臟中MDA含量，說明牯嶺勾兒茶多糖能提高機體抗氧化能力和清除自由基能力，抑制脂質過氧化反應，進而延緩衰老的進程。

[1]陳立,董俊興.勾兒茶屬植物化學成分及其生物活性研究進展[J].中草藥, 2006,37(4):627-630.

[2]安曉娟,馮琳,宋紅平,等.植物多糖的結構分析及藥理活性研究進展[J].中國藥學雜志,2012,47(6):1271-1275.

[3]俞浩,周金星,馬世堂,等.滁菊總黃酮對糖尿病大鼠血液流變學的影響[J].食品工業科技,2013,34(15):351-354.

[4]王思蘆,汪開毓,趙玲,等.雞樅菌多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].中國藥理學通報.2013,29(1):59-63.

[5]熊奇凌,何勝旭,林軍,等.抗癆膠囊對免疫功能低下小鼠影響的實驗研究[J].中國中藥雜志,2013,38(5):740-742.

[6]孫偉,苗珍花,王亞玲,等.寧夏枸杞葉對自然衰老小鼠的抗疲勞作用[J].寧夏醫科大學學報,2011,33(3):204-205.

[7]申佳佳,苑隆國,李電東,等.紅景天苷對自然衰老小鼠模型的抗衰老作用研究[J].中國醫藥生物技術,2012,7.(6):412-417.

[8]吳聰, 施用暉, 樂國偉.奧曲肽對高脂飼養小鼠血糖、血脂及抗氧化能力的影響[J].食品與生物技術學報，2012,37(7):745-751.

[9]Tomoko Kaburagi,Toshihiko Yamano,Yoichi Fukushima,et al.Effect of Lactobacillus johnsonii La1 on immune function and serum albumin in aged and malnourished aged mice[J]. Nutrition, 2007,23(4): 342-350.

[10]Brink TC,Regenbrecht C,Demetrius L,et al. Activation of the immune response is a key feature of aging in mice[J].Biogerontology,2009,10(6):721-34.

[11]王妍，石學魁.玉屏風散增強小鼠免疫功能的研究[J].牡丹江醫學院學報,2010,31(3):46-47.

[12]王玉閣,周麗,王麗萍,等.玉屏風散生物轉化液對正常小鼠抗氧化功能及免疫抑制小鼠T細胞亞群、IL-4 和IFN-γ的影響[J]. 齊齊哈爾醫學院學報,2009,30(5):513-515.

[13]Yan-Mei Tian,Gui-You Zhang,Yao-Ren Dai.Melatonin rejuvenates degenerated thymus and redresses peripheral immune functions in aged mice[J].Immunology Letters, 2003,88 (2 ):101-104.

[14]鐘振國,羅雪菲,黃金蘭,等.余甘子葉提取物對小鼠免疫功能的影響研究[J].中藥材,2013,36(3):441-444.

[15]胡錫琴,李婭琳,林飛,等.何首烏、制何首烏對大鼠免疫球蛋白影響的實驗研究[J].天津中醫藥,2009,26(2):139-141

[16]Bokov A,Chaudhuri A,Richardson A.The role of oxidative damage and stress in aging[J].Mech Aging Dev，2004,125( 10-11): 811-26.