食品中有害物賴丙氨酸的檢測方法綜述1

羅序英，趙燕,*，涂勇剛，王俊杰，李建科，陳彰毅

(1. 南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 南昌大學 生物質轉化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；3. 江西農業大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045)

1964年，Bohak[1]用氨基酸分析儀在堿(pH13)處理后的牛胰臟核糖核酸酶 A(RnaseA)中檢出了一種新的氨基酸——賴丙氨酸( lysinoalanine，LAL )。隨后，學者們廣泛地從酪蛋白酸鈣(鈉)、嬰幼兒配方奶粉、巴氏殺菌乳、面條、烤燕麥、玉米片、煮蛋白、皮蛋、火腿、雞腿肉以及酵母、大豆分離蛋白、蛋清粉等食品或食品原料中也檢出了LAL[2-11]。富含蛋白質的食品或食品原料在高溫或堿處理時易產生LAL，其實，即使是在室溫條件下，也會慢慢形成LAL[6,11]。LAL的產生伴隨著食品中必須氨基酸的減少和外消旋化，使含蛋白質的食品營養價值降低[3,12-15]；它甚至還能螯合金屬酶，特異地引發小鼠腎鈣質沉著、腎細胞巨大及腎小管細胞壞死[16-18]。在很多嬰兒配方食品中，LAL已經開始作為一個質量指標[9,10]，以避免對嬰兒造成傷害。

國外雖已建立了LAL的氨基酸分析儀法[19]、氣相色譜法[6,20]、液相色譜法[4,21]及色譜-質譜聯用法[5,22]等，但LAL的標準分析方法至今仍未確定；國內對LAL的研究幾乎是空白。本文綜述了目前已報道的各種LAL的檢測方法，并總結各自的優缺點，旨在為食品中LAL的檢測方法提供參考和指導，促進LAL的深入研究，確保食品安全。

1 賴丙氨酸的性質

LAL，即Nε-(DL-2-氨基-2羧乙基)-DL-賴氨酸，有2個光學活性中心，因而有兩對旋光異構體，分別為LL-、LD-和DL-、DD-LAL。由于部分賴丙氨酸的形成與氨基酸的外消旋化有關，而形成D-賴氨酸的條件苛刻、時間較長，因此LL-和LD-型比較多見[23]。且用鈉光燈作光源檢測LL-LAL和LD-LAL的旋光度分別為 100.7°和-14.8°[24]。LAL的穩定性比較差，如在乙醇中不穩定；水溶液易受熱分解，60℃就有部分LAL分解，約174℃時LL-、DD-LAL完全分解，約192℃時，LD-、DL-LAL完全分解；在酸水解過程中LAL會迅速消旋化并發生部分分解[23]。

2 樣品前處理

食品中的LAL多與蛋白質結合，因此在分析食品樣品中的LAL時都要先經過水解，使LAL得到釋放。食品中蛋白質的水解方法有酶水解法、微波輔助水解法、堿水解法和酸水解法，前三種方法對某些氨基酸而言存在著水解不徹底、氨基酸水解回收率偏低或者破壞某些氨基酸等缺點；而酸水解尤其是鹽酸水解法是一種采用較多的水解方法，它迅速而徹底[25]。因此，一般用鹽酸水解法來對樣品進行前處理[26]，具體操作為：向樣品中加入適量的6mol/L的鹽酸(以1g蛋白質加200mL鹽酸的比例為佳[4])，并滴入幾滴苯酚作保護劑，在108～110℃水解20～24h，LAL即可得到良好釋放。在分析富含脂肪的樣品時，為避免脂肪干擾LAL的測定，通常需要先對樣品進行脫脂處理[5]。

3 檢測方法

20世紀 60年代初氨基酸分析儀的問世，實現了氨基酸分析的自動化，并使氨基酸分析進入了一個嶄新的階段，也促進了LAL的發現[1]和研究。

20世紀70至80年代，國外學者開始致力于LAL檢測方法的研究，如薄層層析(TLC)法、氨基酸分析儀法和兩步衍生化的氣相色譜(GC)法以及液相色譜(HPLC)法等。除TLC外，其他方法都逐漸地得到發展和運用。用TLC法檢測食品中的LAL時，由于儀器的局限性，樣品中的其它茚三酮陽性化合物會干擾測定結果，特別在測定含少量或不定量LAL的樣品時，結果偏差更大，所以該方法沒有得到深入研究和廣泛使用，目前也基本不用此法測定LAL。當時，兩步衍生化的GC法測定LAL已逐漸成為一種僅次于氨基酸分析儀法的常規化檢測方法；但是，這種方法存在的諸多弊端限制了它的進一步發展。

20世紀90年代以后至今，檢測LAL時用得較多的方法是氨基酸分析儀法、HPLC法和液相色譜-質譜聯用(LC-MS)法。此外，LAL一步衍生化的GC法、脈沖-傅里葉變換核磁共振譜儀法(適合檢測LAL的非對映異構體)和陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法(HPAEC-IPAD)，也具有其各自的優勢。以下分別介紹了LAL的氨基酸分析儀、氣相色譜、液相色譜及色譜-質譜聯用等檢測方法。

3.1 氨基酸分析儀法

氨基酸分析儀法是一種用于檢測LAL的較好方法，它不但靈敏度高、重復性好，還可以同時測定多種氨基酸。其最大特點是衍生化反應發生在氨基酸與其他物質分離之后，即柱后衍生。因此，分離柱的類型(包括柱長和柱內填料)、洗脫液的類型和溫度等的選擇非常重要。Slump[19]曾分別選用Bio-Rad Aminex A-4和Beckman M82填充的50cm離子交換柱分離了LAL與其它氨基酸，發現這兩種填料的分離效果存在差異，用前者分離時，LAL與甲基賴氨酸(Me-LAL)的兩種同分異構體的洗脫時間相同；而后者分離效果略好，只稍微受Me-LAL的一種同分異構體干擾。用氨基酸分析儀檢測LAL時，一般以pH5.3濃度0.35mol/L的檸檬酸鹽緩沖溶液作洗脫液，約 50℃進行茚三酮柱后衍生化，但是，對于某些成分復雜的樣品中 LAL的檢測，顯色反應控制在 50℃左右會帶入某些茚三酮的陽性干擾物，此時要適當提高顯色反應的溫度[9]。茚三酮柱后衍生的方法是美國官方分析化學師協會(AOAC)分析氨基酸的標準方法，Fritsch等[27]提出用氨基酸分析儀測定LAL時，通過改用鄰苯二甲醛柱后衍生并經熒光檢測，靈敏度和準確性較茚三酮柱后衍生法明顯提高。Chang等[3]為探討皮蛋腌制過程中氨基酸的變化及其與LAL形成之間的關系，采用氨基酸分析儀法對皮蛋中的氨基酸和形成的LAL進行了定量。Schwarzenbolz等[28]利用氨基酸分析儀測定了幾種富含蛋白質的食品在高壓處理過程中產生的LAL，并發現LAL的形成量隨壓力增大而增多。

3.2 氣相色譜法

LAL作為一種交聯氨基酸，不能直接用GC進行檢測，必須經過衍生得到弱極性、低揮發性和良好熱穩定性的衍生物后才能用 GC分離測定。LAL的衍生化方法不及普通氨基酸的衍生化方法(包括酯化-酰化反應、烷基化反應、硅烷化反應等)多。

早期，用GC法檢測LAL時，一般通過兩步(BTFA)衍生法進行柱前衍生化，反應方程式如圖1a，第一步利用正丁醇、異丁醇或異丙醇等與LAL發生酯化反應；第二步利用三氟乙酸酐、五氟丙酸酐或七氟丁酸酐等與第一步所得產物進行酰化反應。Hasegawa等[20]分別用正丁醇和三氟乙酸酐作酯化和酰化試劑，并用2%OV-17/1%OV-210固定液的填充柱進行分離，以丁基山崳酸作內標來定量，檢測出堿處理的面筋、大豆球蛋白、溶解酵素和乳白蛋白等樣品中的LAL含量。正丁醇和三氟乙酸酐是兩步衍生化常用的試劑，但學者們通過改用其它酯化或酰化試劑同樣達到了較理想的衍生效果。Buser等[29]改用七氟丁酸酐作酰化試劑，并采用硅烷化高硼硅玻璃柱和氮磷檢測器(NPD)分別進行分離和檢測，該方法的精密度與離子交換色譜法相近，檢出限可低至100μg/g(以蛋白質含量計)。

圖1 LAL的酯化-酰化(a)和MTBSTFA(b)衍生化反應Fig.1 Derivatization of LAL with BTFA reagent(a)or MTBSTFA(b)

由于兩步衍生化法的酰化和酯化反應是在互不相容的介質中進行，第一步結束后需將產物旋轉蒸發蒸干，處理較繁雜。近期興起的另一種衍生化方法是用硅烷化試劑——N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)與LAL發生親核反應進行一步衍生，即MTBSTFA中的Si與LAL上的N、O結合生成tBDMSi-LAL化合物(反應方程式如圖1b)，然后用GC-FID或GC-NPD等進行檢測[30]。Montilla等[6]和Bosch等[31]首次在溫和的條件下利用MTBSTFA對LAL進行了衍生，選用2,6-二氨基庚二酸(DPA)作內標，利用GC-FID法對禽蛋、牛奶等制品中的LAL進行了準確定量。該方法樣品處理簡單，衍生反應條件溫和，可避免大量LAL分解，采用毛細管柱分離靈敏度和分離度更高，檢測限較低(約50μg/g)，回收率較高(約94%)，且整個過程不需純化樣品，預處理方便，只需一步衍生化即可進樣檢測。

兩步衍生化的氣相色譜法曾被大量用來測定各種食品中的LAL，但是因為其衍生處理繁雜且條件苛刻，易造成LAL的部分分解，該方法未能繼續推廣。氣相色譜法本不是常規氨基酸的常規測定方法，由于一步衍生化的氣相色譜法在測定LAL時存在一定的優勢，該方法值得繼續改進后進一步推廣。

3.3 液相色譜法

分析氨基酸所用的高效液相色譜主要是反相高效液相色譜(RP-HPLC)。用此方法分析 LAL的關鍵和GC法一樣，在于衍生試劑的選擇。目前主要用5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(簡稱丹磺酰氯，即DNS-Cl)和氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)。它們都能與一、二級氨基酸反應，為充分反應并使衍生產物單一，衍生試劑必須過量。相應的反應方程式分別如圖2a和2b所示。

圖2 LAL分別與DNS-Cl(a)和FMOC-Cl(b)的衍生化反應Fig.2 Derivatization of LAL with DNS-Cl(a)or FMOC-Cl(b)

Badoud等[32]曾在用DNS-Cl衍生LAL時，以Li2CO3作緩沖溶液，并用甲胺鹽酸鹽來徹底終止反應，達到了穩定DNS-LAL衍生物和減少了因過量DNS-Cl和DNS-LAL重新反應產生大量DNS-NH2副產物的目的；此外，他們在HPLC分析過程中利用Nε-甲基-賴氨酸作內標來定量，并采用梯度洗脫程序，進而使結果更準確，同時大大縮短了LAL出峰時間。由于存在樣品本身性質的差異和方法的局限性，學者們還在繼續探索用HPLC檢測各種食品中的LAL。Faist等[4]和Al-Saadi等[33,34]在分析UHT乳、巴氏殺菌乳和酪蛋白等樣品中的LAL時，通過改變DNS-Cl用量，或采用不同液相柱和不同HPLC的洗脫程序，甚至改用精密度更高的熒光檢測器等方式，以達到快速檢測、精確分析的目的，尤其Al-Saadi等[34]通過用這種方法測定UHT乳中LAL含量，研究了貯存溫度對LAL形成量的影響。

FMOC-Cl是氨基酸 HPLC分析法中的一種常用柱前衍生試劑，可在室溫條件下進行衍生化反應。Pellegrino等[21]將FMOC-Cl用于LAL的衍生化，建立了奶制品中LAL的HPLC檢測法，該方法變異系數小、靈敏度高、檢測限低(約 0.4μg/g)。因為樣品中 LAL含量較低，而固相萃取(SPE)技術對微量或痕量目標化合物的提取、分離能力較強，所以該方法在衍生結束后通常需用SPE對相應衍生產物進行濃縮、提取和分離。Cattaneo等[2,9]就是用這種方法測定了幾種奶制品中的LAL含量，以此作為產品熱損傷程度的指標之一，并對比了在酪蛋白加工成酪蛋白酸鈣(鈉)過程中形成的LAL量。

DNS-Cl衍生化的HPLC法檢測時間雖更短，但衍生副產物較多，對LAL的測定易造成一定的干擾；FMOC-Cl衍生化的HPLC法引入SPE處理，干擾小，重復性較好。

3.4 色譜-質譜聯用技術

食品樣品成分復雜、LAL含量低，單一的分離檢測方法往往難以滿足復雜樣品分析檢測的要求。色譜-質譜聯用技術的引入既能發揮色譜法的高分離能力，又能發揮質譜法的高鑒別能力，減少假陽性發生幾率。至今為止對食品中LAL的測定主要集中在氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)和液相色譜-質譜聯用(LC-MS)技術，FMOC-Cl衍生化的LC-MS方法是目前檢測食品中LAL的重要手段之一。

GC-MS技術的引入相對GC提高了樣品組分的定性能力，但是樣品衍生的優缺點與GC法仍是一致的。Hasegawa等[5]在對樣品脫脂和除碳水化合物后，用兩步衍生法對其衍生化，再用GC-MS測定了小麥制品、奶制品、豆制品和肉制品等樣品中的LAL含量。在Montilla等[6]和Bosch[31]建立的一步衍生化的GC-FID法中，也利用了GC-MS所得的特征碎片離子(如m/z 632；m/z387)來對LAL定性。

LC-MS技術用于食品中LAL的檢測，靈敏度和準確性比HPLC法更高；由于它可以得到各組分的質量信息來排除樣品中其它組分的影響，所以不需要對衍生后的樣品進行SPE處理，既簡單又節省了樣品處理時間。Calabrese等[22]將樣品經FMOC-Cl衍生化后，直接利用LC-MS技術，準確地測定了牛奶和奶酪中的LAL。此外，Fenaille等[35]以d4-羧甲基賴氨酸(d4-CML)作內標，并以鹽酸正丁醇溶液作衍生試劑，利用LC-MS/MS測定了嬰幼兒配方奶、巴氏殺菌乳和UHT乳中LAL的含量。

3.5 其他

其他技術如脈沖-傅里葉變換核磁共振譜儀也曾用于LAL的研究中，Boschin等[36,37]以四甲基硅烷作內標，D2O作溶劑，用脈沖-傅里葉變換核磁共振譜儀測定了合成的LAL中的兩種非對映異構體的比例。整個分析過程不需要衍生，處理簡單，但其只適于合成的LAL及其標準品的檢測，并不適合成分復雜的食品中LAL的分析。近年來，陰離子交換色譜-積分脈沖安培(HPAEC-IPAD)技術也開始運用到LAL的檢測中。Rombouts等[38]采用 HPAEC-IPAD法，雙柱串接分離和用四元梯度洗脫系統洗脫，檢測使用金工作電極和pH參比電極，直接測定了面筋蛋白中的基本氨基酸和LAL的含量，該方法無需衍生，操作簡單且重現性好，但也存在重復性差、電極損耗大和費用高等缺點。因此，無論是 LAL分析的核磁共振譜儀法和HPAEC-IPAD技術都尚不及前面幾種方法應用廣泛，這幾種方法固然存在各自的特點(表1)。

表1 LAL的各種常用檢測方法的比較Table.1 The comparison of common detection methods for LAL

點 應用單一；該方法分析條件不易改變，對少于100μg/g的LAL定量不準確[27]樣品前期處理復雜、耗時；LAL高溫尤其含鹽酸時易分解[29,30]劑較貴；衍生試劑及衍生產物的穩定性不太理想，需要嚴格隔離水分[31]貴；衍生后有DNS-OH、DNS-NH2和其它柱前衍生干擾物干擾檢測[32]貴；HPLC法中SPE提取過程復雜、耗時[4]

4 結論與展望

目前，分析LAL的主要方法是氨基酸分析儀法、HPLC和LC-MS法。在開展LAL的理論研究時，通常不僅要測定樣品中 LAL含量，也需對其他多種氨基酸定量，這種情況下可選擇氨基酸分析儀法；對某些成分復雜且LAL含量低的樣品，可能會受水解過程中LAL回收不完全的影響，分析時出現重峰，這些樣品可能比較適合用FMOC-Cl衍生化的HPLC法(包括聯用SPE或MS技術)分析。另外，MTBSTFA衍生化的GC法，特別是GC-MS法靈敏度和準確性高，且樣品衍生處理較HPLC或LC-MS法簡單，因此它也是很具潛力的一種檢測食品中LAL的方法。但是，任何方法都不是通用的，都有其優缺點和適用范圍，正如氨基酸分析儀法定量低含量 LAL時準確性較低，HPLC法樣品處理更繁雜，且它與GC法都易受其他分離物的影響。在選擇方法時，應充分考慮樣品的特征、LAL的特性、儀器的靈敏度、方法的可行性以及成本的高低，結合實際條件，選用合適的方法。針對國內對LAL研究基礎薄弱的現狀，找到更準確更通用的檢測方法，將是我們對LAL研究的重要任務之一。

[1]Bohak Z. Nε-(DL-2-amino-2-carboxyethyl)-L-lysine, A new amino acid formed on alkaline treatment of proteins[J]. Journal of Biological Chemistry, 1964, 239(9): 2878-2887.

[2]Cattaneo S, Masotti F, Pellegrino L.Chemical modifications of casein occurring during industrial manufacturing of milk protein powders[J]. European Food Research and Technology, 2012, 235(2): 315-323.

[3]Chang H M, Tsai C F, Li C F. Changes of amino acid composition and lysinoalanine formation in alkali-pickled duck eggs[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(4): 1495-1500.

[4]Faist V, Drusch S, Kiesner C, et al. Determination of lysinoalanine in foods containing milk protein by high-performance chromatography after derivatisation with dansyl chloride[J]. International Dairy Journal,2000, 10(5): 339-346.

[5]Hasegawa K, Mukai K, Gotoh M, et al. Determination of the Lysinoalanine Content in Commercial Foods by Gas Chromatography-selected Ion Monitoring (Food & Nutrition)[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1987, 51(11): 2889-2894.

[6]Montilla A, G Mez-Ruiz J á, Olano A, et al. A GC-FID method for analysis of Lysinoalanine[J].Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51(4): 415-422.

[7]Pellegrino L, Cattaneo S, Masotti F, et al. Detection of milk powder and caseinates in Halloumi cheese[J]. Journal of Dairy Science, 2010, 93(8): 3453-3460.

[8]Sieber R, Buetikofer U, Kaldas N, et al. Occurrence of lysinoalanine in milk and dairy products[J].Revue Suisse D'agriculture, 2007, 39(6): 297-302.

[9]Cattaneo S, Masotti F, Pellegrino L. Liquid infant formulas: technological tools for limiting heat damage[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(22): 10689-10694.

[10]Cattaneo S, Masotti F, Pellegrino L. Effects of overprocessing on heat damage of UHT milk[J].European Food Research and Technology, 2008, 226(5): 1099-1106.

[11]董攀，趙燕，楊有仙，等.食品加工過程中有害物質——賴丙氨酸研究進展[J].食品科學，2011，32(15)：312-316.

[12]Friedman M. Origin, Microbiology, Nutrition, and Pharmacology of D-Amino Acids[J]. Chemistry &Biodiversity, 2010, 7(6): 1491-1530.

[13]Sarwar Gilani G, Wu Xiao C, Cockell K A. Impact of Antinutritional Factors in Food Proteins on the Digestibility of Protein and the Bioavailability of Amino Acids and on Protein Quality[J]. British Journal of Nutrition, 2012, 108(S2): S315-S332.

[14]Gilani G S, Cockell K A, Sepehr E. Effects of antinutritional factors on protein digestibility and amino acid availability in foods[J]. Journal of AOAC International, 2005, 88(3): 967-987.

[15]Gilani G S, Sepehr E. Protein digestibility and quality in products containing antinutritional factors are adversely affected by old age in rats[J]. The Journal of Nutrition, 2003, 133(1): 220-225.

[16]Jonker D, Woutersen R, Feron V. Toxicity of mixtures of nephrotoxicants with similar or dissimilar mode of action[J]. Food and Chemical Toxicology, 1996, 34(11): 1075-1082.

[17]Pearce K N, Friedman M. Binding of copper (II)and other metal ions by lysinoalanine and related compounds and its significance for food safety[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1988, 36(4):707-717.

[18]Somoza V, Wenzel E, Wei C, et al. Dose-dependent utilisation of casein-linked lysinoalanine, N(epsilon)-fructoselysine and N (epsilon)-carboxymethyllysine in rats[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2006, 50(9): 833-841.

[19]Slump P. Determination of lysinoalanine with an automatic amino-acid analyzer[J]. Journal of Chromatography A, 1977, 135(2): 502-507.

[20]H ASEGAWA K, OKAMOTO N. Studies on the gas chromatographic analysis of lysinoalanine in alkali-treated food proteins [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1980, 44(3): 649-655

[21]Pellegrino L, Resmini P, De Noni I, et al. Sensitive determination of lysinoalanine for distinguishing natural from imitation Mozzarella cheese[J]. Journal of Dairy Science, 1996, 79(5): 725-734.

[22]Calabrese M G, Mamone G, Caira S, et al. Quantitation of lysinoalanine in dairy products by liquid chromatography-mass spectrometry with selective ion monitoring[J]. Food Chemistry, 2009, 116(3):799-805.

[23]Liardon R, Friedman M, Philippossian G. Racemization kinetics of free and protein-bound lysinoalanine (LAL)in strong acid media. Isomeric composition of bound LAL in processed proteins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1991, 39(3): 531-537.

[24]Tas A, Kleipool R. The stereoisomers of lysinoalanine[J]. Lebensm Wiss-Technol, 1979,9:360-363.

[25]孫秋君，陳曉曄，朱建良.蛋白質降解及其產物氨基酸檢測的研究進展[J].食品工業科技，2011，11(32)：525-528.

[26]Garcia R, Pyle D, Piazza G, et al. Hydrolysis of animal protein meals for improved utility in non-feed applications[J]. Applied Engineering In Agriculture, 2011, 27(2): 269-275.

[27]Fritsch,R J, Klostermeyer H. Improved method for determination of lysinoalanine in food[J].Zeitschrift Fur Lebensmittel-Untersuchung Und-Forschung .1981, 172(6):101-106.

[28]Schwarzenbolz U, Henle T. Non-enzymatic modifications of proteins under high-pressure treatment[J].High Pressure Research, 2010, 30(4): 458-465.

[29]B Ser W, Erbersdobler H. Determination of lysinoalanine as the heptafluorobutyryl isobutyl ester derivative by gas-liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography, 1984, 303(1): 234-237.

[30]Jimenez-Martin E A, Ruiz J, Perez-Palacios T, et al. Gas Chromatography-Mass Spectrometry Method for the Determination of Free Amino Acids as Their Dimethyl-tert-butylsilyl (TBDMS)Derivatives in Animal Source Food[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(10): 2456-2463.

[31]Bosch L, Sanz M L, Montilla A, et al. Simultaneous analysis of lysine, Nε-carboxymethyllysine and lysinoalanine from proteins[J]. Journal of Chromatography B, 2007, 860(1): 69-77.

[32]Badoud R, Pratz G. Simple and rapid quantitative determination of lysinoalanine and protein hydrolysate amino acids by high-performance liquid chromatography after derivatization with dansyl chloride[J]. Chromatographia, 1984, 19(1): 155-164.

[33]Al-Saadi J, Deeth H C. Cross-linking of proteins and other changes in UHT milk during storage at different temperatures[J]. Australian Journal of Dairy Technology, 2008, 63(3): 93-99.

[34]Al-Saadi J, Easa A M, Deeth H C. Effect of lactose on cross-linking of milk proteins during heat treatments[J]. International Journal of Dairy Technology, 2013, 66(1): 1-6.

[35]Fenaille F, Parisod V, Visani P, et al. Modifications of milk constituents during processing: A preliminary benchmarking study[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(7): 728-739.

[36]Boschin G, Scaglioni L, Arnoldi A. Optimization of the synthesis of the cross-linked amino acid ornithinoalanine and nuclear magnetic resonance characterization of lysinoalanine and ornithinoalanine[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(3): 939-944.

[37]Boschin G, D’Agostina A, Arnoldi A. A convenient synthesis of some cross-linked amino acids and their diastereoisomeric characterization by nuclear magnetic resonance[J]. Food Chemistry, 2002, 78(3):325-331.

[38]Rombouts I, Lagrain B, Brijs K, et al. Cross-linking of wheat gluten proteins during production of hard pretzels[J]. Amino acids, 2012, 42(6): 2429-2438.