不同生長階段保加利亞乳桿菌關鍵蛋白酶基因表達變化規律*

韓巍巍，侯俊財，曹秋閣，高夢妮，張佳秀，吳瑤，李曉靜

1(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150030)2(東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱，150030)

保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)是革蘭氏陽性、兼性厭氧、同型乳酸發酵的乳酸菌，是發酵酸奶的典型發酵劑［1］。保加利亞乳桿菌對營養需求比較苛刻，不能同化無機氮源，因此，為了保證保加利亞乳桿菌在乳中的營養需求，必須依靠其有效的蛋白水解酶系作用酪蛋白基質產生短肽和釋放游離氨基酸［2］。研究表明，保加利亞乳桿菌菌株間的蛋白水解活力存在較大差異［3］。保加利亞乳桿菌高效復雜的蛋白水解酶系主要由3部分組成:將酪蛋白降解成大分子多肽的細胞壁結合蛋白酶(PrtB);轉運氨基酸和多肽穿過細胞質膜的肽轉運體系(Opp、Dpp和DtpT轉運體系);進一步降解多肽形成短肽和氨基酸的胞內肽酶［4－5］。目前，保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中部分相關酶的基因已被檢出，國內外學者多利用分子技術研究這些基因在轉錄水平上表達的變化規律［2，6］。與乳酸乳球菌和瑞士乳桿菌相比，對保加利亞乳桿菌的蛋白水解酶系相關酶基因表達量的研究較少［7］，尤其國內少有報道，本文旨在mRNA轉錄水平上，應用實時熒光定量PCR技術，探討保加利亞乳桿菌的蛋白水解體系中關鍵蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)在菌體不同生長階段表達規律。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及設備

菌株:德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus debreuckii ssp.bulgaricus)KLDS 1.0207、1.0501、1.1007、1.9201、1.9203、1.0208 由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室分離保藏。

主要試劑:復原脫脂乳(新西蘭)、EDTA·2Na(Amresco)、鄰苯二甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)、DEPC(科爾生物有限公司)、RNAprep pure培養細菌總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)、PrimerScript? RT反轉錄試劑盒(寶生物大連工程有限公司)、SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(寶生物大連工程有限公司)。

主要設備:離心機，上海安亨科學儀器廠;PCR儀，杭州博日科技有限公司;電泳儀，北京市六一儀器廠;紫外分光光度計，Japan;實時定量PCR儀，英濰捷基上海貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的生長曲線

菌株2%接種于MRS液體培養基中，37℃活化3代，然后用12%滅菌脫脂乳37℃傳代3次，充分恢復菌株蛋白水解活力，保藏4℃備用。將活化后的菌種2%接入滅菌脫脂乳，37℃培養。每隔2h取樣測定生物量和pH值，獲得生長曲線和pH變化曲線。

生物量的測定:取0.5 mL培養物，加入4.5 mL 0.2%的EDTA·2Na，漩渦混勻，以12%的NaOH溶液調節pH值至12，漩渦混合后，波長410 nm處測定吸光值，空白對照為未接菌的滅菌脫脂乳。每組3次重復［8］。采用pH計測定pH值。

1.2.2 保加利亞乳桿菌蛋白水解活力的測定

菌株的蛋白水解活力測定參考 Church［9］的鄰苯二甲醛(OPA)方法。

將活化好的菌株按2%接種于滅菌脫脂乳中，37℃培養。每隔2 h取樣品2 mL，加入4 mL 0.75 mol/L三氯乙酸溶液，漩渦混勻，6 000×g離心5 min。取150 μL上清液與3 mL OPA試劑混合并開始準確計時5 min，在340 nm波長下比色。

1.2.3 保加利亞乳桿菌關鍵蛋白水解酶基因的相對表達

1.2.3.1 實時熒光定量PCR引物設計與合成

以16s rRNA作為內參基因(管家基因)［10］，各基因引物根據GenBank提供的Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 11842的DNA序列(GenBank accession number:NC_008054.1)中相應基因的序列，采用primer5.0軟件設計，由上海生工生物技術有限公司合成，具體見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 The primer of real-time RT-PCR

1.2.3.2 提取的RNA

將活化好的菌株接種于2%滅菌脫脂乳37℃培養，取4、8、12和16 h發酵乳10 mL于90 mL 2%檸檬酸三鈉溶液中，充分混勻，取10 mL懸浮液離心(6 000 × g，5 min，4 ℃)，棄上清液收集菌體［11］。按照RNAprep pure培養細菌總RNA提取試劑盒的說明書立即抽提樣品的總RNA。

1.2.3.3 反轉錄合成cDNA

采用PrimerScript? RT反轉錄試劑盒將提取的總RNA反轉錄成cDNA，反轉錄產物樣本于－20℃保存備用。RT反應液成分:5×PerimeScirptR Buffer 8.0 μL;PerimeScirptR RT Enzyme Mix I 2.0 μL;Oligo dT Primer(50 μmol/L)2.0 μL;Random 6 mers(100 μmol/L)2.0 μL;RNA 模板 20.0 μL，總體系為 40.0 μL。反轉錄反應條件:37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.2.3.4 實時熒光定量PCR

使用 SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒配制PCR反應液。反應體系:SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)10.0 μL;上下游引物(10 μmol/L)各0.40 μL;ROX Reference Dye II(50 ×)0.40 μL;反轉錄產物cDNA(稀釋 10 倍)2.0 μL，ddH2O(滅菌雙蒸水)6.80 μL，總體系為 20.0 μL。使用 ABI 7500 Real-Time PCR System進行實時熒光定量PCR實驗。本實驗采用兩步法PCR擴增標準程序:預變性:95℃ 30 s;PCR 反應:95℃ 5 s，60℃ 34 s，循環(40次)。不同反應體系樣品做3次重復。

1.2.4 統計分析

將每個待測樣品均設3次重復，分析各基因的CT值，利用2－△△CT法對目的基因的表達量進行評估［12］。采用SPSS16.0軟件進行方差分析，多重比較采用Duncan方法，P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌的生長曲線

為了了解菌體在脫脂乳中的生長狀況，本實驗測定了6株保加利亞乳桿菌的生長曲線(圖1)。在相同培養條件下，所有菌株均在培養4 h時進入對數期，其中KLDS1.0501、1.9201和1.0208在12 h時進入穩定期，KLDS 1.0207和1.1007在培養10 h進入穩定期，而KLDS 1.9203進入穩定期的時間為14 h。其中，KLDS 1.9201菌株的活力最強，KLDS 1.0207和1.1007的活性較弱。

圖1 保加利亞乳桿菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Lacbobacillus bulgaricus

2.2 保加利亞乳桿菌的pH值變化曲線

6株保加利亞乳桿菌的pH變化曲線見圖2。由圖可見，發酵初期，pH值下降速度緩慢，菌體進入對數期后，迅速產酸，pH值快速下降。KLDS 1.9201的pH下降最快，產酸能力也最強，而KLDS 1.0207和1.1007的pH下降緩慢，產酸能力較弱。

2.3 保加利亞乳桿菌的蛋白水解曲線

硫醇條件下，OPA可與游離氨基酸的氨基末端反應生成一種熒光化合物，在波長340 nm產生強吸收。依據乳蛋白被水解的程度測定乳酸菌的蛋白水解活力，OPA指數越大表示乳酸菌的蛋白水解能力越強。由圖3可以看出，隨著培養時間的延長，6株保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力極顯著增強(P＜0.01)，且水解曲線的線性基本一致，菌株 KLDS 08014的蛋白水解活力最強。6株菌在12%脫脂乳中培養12 h時，以L-亮氨酸標準曲線計算相當于亮氨酸的游離氨基酸的濃度，菌株KLDS 1.9201、1.0208、1.0501、1.9203、1.1007 和 1.0207 分別為 384.33 ±0.001 2、255.50 ±0.000 0、181.50 ±0.002 0、164.15 ±0.002 0、155.83±0.001 2和92.17±0.001 5 mg/L。

圖2 保加利亞乳桿菌的pH值變化Fig.2 The pH dynamic of Lacbobacillus bulgaricus

圖3 保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力變化Fig.3 The proteolytic activity dynamic curve of Lacbobacillus bulgaricus

2.4 不同生長階段保加利亞乳桿菌關鍵蛋白水解酶基因相對表達量的動態變化

2.4.1 實時熒光定量PCR的結果

實時熒光定量PCR所得的內參基因(16srRNA)和目的基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的熔解曲線如圖4所示。熔解曲線中呈現單一峰，排除了形成引物二聚體和非特異產物對試驗結果的影響，同時說明設計引物的特異性良好。

2.4.2 不同生長階段關鍵蛋白水解酶基因相對表達量的動態變化

6株保加利亞乳桿菌在發酵期間蛋白水解體系中關鍵蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表達水平不同(圖 5)。菌株 KLDS 1.9201和1.0208的7個目的基因與對照組(4 h)相比，對數期(12 h)和穩定期(16 h)的基因表達量均上調。6株菌的prtB和oppD基因在對數期的相對表達量高于對照組(4 h)。菌株KLDS 1.0501和1.9203內prtB基因，在培養12 h時最大，且差異極顯著高于各自對照組(P＜0.01)，菌株 KLDS 1.0207、1.1007、1.9201和1.0208在對數期和穩定期的相對表達量都有上調。菌株KLDS08007和08012內oppD基因則在對數期上調，穩定期下調，而菌株KLDS 1.0207、1.0501、1.9203和1.0208對數期與穩定期均極顯著上調(P＜0.01)。6株菌的胞內肽酶基因(pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表達量與對照組(4 h)相比，對數期均極顯著上調(P＜0.01)，除了菌株KLDS 1.0207的pepQ基因在對數期下調，但是穩定期是上調的。隨著菌體在脫脂乳中的不斷生長，6株菌的pepC和pepF基因在對數期和穩定期的表達量高于對照組，其中KLDS 1.0207菌株的穩定期比對數期上調幅度大，分別為提高了6.34倍和23.57倍。菌株KLDS 1.0501的pepC基因在對數初期和穩定期雖然相對表達量上調，但是差異不顯著(P＞0.05)。

圖4 內參基因和目的基因PCR產物的熔解曲線Fig.4 The melt curves of PCR products of endogenous reference gene and target gene

圖5 不同生長階段關鍵蛋白水解酶基因的相對表達量Fig.5 Kinesis of the key protease genes expression during the different growth phase

3 討論

1974年 Mckay和 Baldwin［13］首次證明乳酸菌降解乳中酪蛋白的實質是乳酸菌自身特有的高效蛋白水解系，他們發現乳酸乳球菌蛋白酶基因質粒的治愈菌株在乳中不能高密度生長，然而在添加水解酪蛋白的乳中，質粒治愈菌株就會同正常菌株一樣生長。乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白，分別占乳中總蛋白的80%和20%。酪蛋白分子含有乳酸菌在乳中高密度生長所需要的所有氨基酸，然而，實際上在乳發酵過程中，只有1% ～2%的牛乳經過水解，其水解底物是酪蛋白，而乳清蛋白的水解受到限制［14］。

研究報道，乳酸菌的不同菌種和菌株間的蛋白水解能力差異很大，其中嗜熱乳桿菌(瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌等)的蛋白水解能力最高，嗜熱鏈球菌則最低(2.4 ～14.8 mg/L)［2］。本實驗研究了6株保加利亞乳桿菌的蛋白水解活力，菌株間的蛋白水解活力有顯著差異，并發現菌體在脫脂乳中發酵時間越長，蛋白水解活力越強，與 Donkor等［15］報道的 Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus 1466在還原脫脂乳中的研究結果一致。菌體在脫脂乳中處于延遲期時，菌體利用乳中少量游離氨基酸供菌體生長，進入對數期后，乳中的游離氨基酸不能滿足菌體生長的正常氮源需求，因此，菌體依賴自身蛋白水解體系有效的降解乳中外源蛋白質，利用降解產物供菌體生長。Simova［16］研究生長期和培養基對乳酸菌發酵劑產肽酶活性的影響時得出 Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus 2－11發酵6 h的游離氨基酸濃度為143.6 μmol/L。呂加平等［2］測得保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌水解乳蛋白后游離氨基酸質量濃度為61.0～144.6 mg/L。在本研究中，保加利亞乳桿菌在乳中培養12 h的蛋白水解活力最高為384.33 mg/L，最低為92.17 mg/L，因此，本實驗的保加利亞乳桿菌具有較高的蛋白水解活性。

乳酸菌為了維持自身的氮平衡，可能通過調節蛋白水解體系的酶活力來改變培養基質的氮源含量。研究表明蛋白酶PrtP以及轉運系統Opp是乳酸菌在乳中生長必不可少的，因為它們參與乳蛋白的第一步降解和轉運吸收所產生的相應肽。菌株在對數期和穩定期基因表達量上調的原因可能是此時菌體大量繁殖，需要大量的游離氨基酸，其蛋白水解酶基因大量表達，酶作用乳蛋白，生成可利用的游離氨基酸和短肽，供菌體生長需要。其中胞內肽酶基因的相對表達量要高于胞壁蛋白酶基因和轉運體系酶基因的相對表達量。Liu等［17］在建立乳清培養 Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus 2038的蛋白水解體系和氨基酸合成代謝的模型時，研究菌體在不同生長階段的基因表達情況，與本實驗結果相符。Gitton等［18］通過蛋白組學的方法發現Lactococcus lactis NCDO763的opp、pepC和pepF基因在缺乏游離氨基酸和肽的培養基上生長時表達量提高，與本研究結論一致。有研究報道，在轉錄水平探討Lactobacillus casei Zhang在豆乳生長過程中，細胞內的5種肽酶pepCl、pepC2、pepN、pepX、pepT －2 基因顯著上調控［19］。Azcarate-Peril等［20］在11%脫脂乳中培養Lactobacillus acidophilus時發現在整個培養過程中，prtP和pepC基因直線上調，pepT和pepX基因培養4 h后直線上調，與本實驗結果一致。近年來，對乳酸菌蛋白代謝機制的進一步研究主要集中在分子生物學調控方面［21－22］，從基因水平利用代謝調控手段提高乳酸菌的高密度生長和代謝水平獲得高水平的發酵產品。

4 結論

本實驗結果表明，隨著保加利亞乳桿菌在脫脂乳中的不斷生長，其蛋白水解活力極顯著增強，同時研究發現蛋白水解活力較高的菌株，其生長和產酸特性也較高。實時熒光定量PCR分析表明，在脫脂乳中培養保加利亞乳桿菌，其關鍵蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表達量呈時間依賴性，且菌株間各蛋白酶基因表達量有較大差異。

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