靈芝雜交菌株選育及其菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵動力學*

王天嬌，唐傳紅，張勁松，徐凱，劉艷芳，楊焱，唐慶九，賈薇，劉方

1(上海海洋大學食品學院，上海，201306)2(國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，上海，201403)

靈芝是中醫(yī)藥中的一種珍貴的傳統(tǒng)藥用真菌［1］。靈芝中的三萜類化合物具有保肝、抗腫瘤、消炎抗菌、抗衰老、降低膽固醇等多種生理功能［2－5］，成為近年研究熱點之一。

孢子雜交育種是經(jīng)典的食用菌雜交育種模式，靈芝擔孢子由于難以萌發(fā)而使這種方法難以用于靈芝的育種工作。利用原生質(zhì)體單核化雜交育種技術(shù)可以克服靈芝孢子難以萌發(fā)這一瓶頸［6］。林俊華等［7］研究對比分析了3個靈芝原生質(zhì)體單核化雜交子及其親本的菌絲生長速度、產(chǎn)量、出菇期、有效成分含量等參數(shù)，發(fā)現(xiàn)雜交子表現(xiàn)出明顯的雜交優(yōu)勢，說明靈芝原生質(zhì)體單核化雜交育種技術(shù)有實用價值。

目前，已從靈芝子實體中分離純化出三萜類化合物160多種［8］，由于靈芝子實體中所含靈芝酸的種類多，難于大量的獲得靈芝中的三萜化合物，因此關于其生物活性的研究往往由于樣品難以準備而無法深入研究其生物學活性。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，靈芝發(fā)酵菌絲體中含有的三萜成分比子實體少，也具有多種生物活性，且液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)三萜類化合物具有生產(chǎn)周期短、成本低、含量穩(wěn)定、適于工廠化生產(chǎn)等特點［9－10］，因此液體發(fā)酵技術(shù)已成為獲取靈芝三萜類化合物的有效手段之一。國內(nèi)外有關靈芝深層發(fā)酵動力學研究的報道已有很多［9］，主要集中在靈芝多糖方面，而關于利用雜交育種手段獲得高產(chǎn)靈芝三萜菌株并研究其三萜類化合物深層發(fā)酵動力學的研究鮮有報道。

本文利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)，獲得靈芝單核菌株，以這些單核菌株作為雜交育種材料，得到雜交菌株，并通過拮抗反應驗證是否雜交成功。進一步用Logistic模型對靈芝雜交菌株菌絲體生長、葡萄糖消耗和總?cè)坪铣傻谋人俾蔬M行分析，篩選出有高產(chǎn)靈芝三萜的菌株，為進一步的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

3株靈芝供試菌株 G0119(滬農(nóng)靈芝1號)，G0130(滬農(nóng)靈芝4號)和G0154(滬農(nóng)靈芝2號)均用于靈芝的栽培生產(chǎn)，具有優(yōu)異的農(nóng)藝現(xiàn)狀和較好的生物活性，由中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，加1 000 mL水煮沸后過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉25 g，補加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌15 min后備用。

種子培養(yǎng)基:除不添加瓊脂粉外其他成分同斜面培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):豆餅粉 30，可溶性淀粉 20，MgSO4·7H2O 2.25，KH2PO41.5，自然 pH，121 ℃滅菌15 min后備用。

1.3 實驗設備

酶標儀，美國Bio-Tek公司BioTek-Synergy HT多功能酶標儀;離心機，美國Beckman公司Allegratm25R Centrifuge離心機;搖床，上海杜科自動化設備有限公司DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床;生化培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司LRH-250生化培養(yǎng)箱。

1.4 分析方法

原生質(zhì)體單核體的制備:見參照文獻［11］。

生物量的測定:取搖瓶發(fā)酵液100 mL，在9 000 g下離心10 min后，棄上清液，取沉淀用去離子水洗滌2次，收集后放在60℃的烘箱中烘干至恒重，精確稱重。

還原糖的測定:DNS比色法［12］。

總?cè)坪康臏y定:齊墩果酸比色法［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝單核體菌株的獲得

選取3株用于靈芝栽培生產(chǎn)上親本菌株G0119，G0130和G0154作為出發(fā)菌株，根據(jù)原生質(zhì)體單核體的制備方法制備3株親本菌株的單核體，結(jié)果見表1。

表1 單核菌株的數(shù)量以及單核獲得比例Table 1 The quantity of monocytic strains and the rate of monokaryogenesis

由表1可以看出，靈芝親本菌株G0119的單核菌株得率是比較低的，為 18.01%，而 G0130和G0154獲得單核菌株的幾率是比較高的，單核得率分別為40.22%和33.67%。

不同靈芝菌株獲得的單核體的交配型的分類結(jié)果如表2所示。由表2結(jié)果可知，同一菌株2種交配型單核菌株獲得的比例是不同的。

表2 交配型測定結(jié)果Table 2 The results of mating type

2.2 靈芝雜交菌株

將篩選出的來自3株不同靈芝親本的單核菌株進行兩兩配對，配對時挑取2塊不同的單核菌株接種到PDA平板上，當2菌塊的前端菌絲交錯在一起時，制片在顯微鏡下觀察菌絲是否有鎖狀聯(lián)合，有鎖狀聯(lián)合者，即為雜交菌株［14－16］。初步鑒定出的雜交菌株63株的編號和親本信息如表3所示。

2.3 靈芝雜交菌株的驗證

取某一菌株與其2個親本菌株接種于同一培養(yǎng)皿中，觀察三者間拮抗反應以判斷菌種雜交是否成功。圖1為雜交菌株與其親本間的拮抗實驗的圖片，圖1顯示雜交菌株雜1(圖1中G1)與親本G0019，G0130，雜交菌株雜50(圖1中 Z3)與親本 G0130，G0154以及雜交菌株雜 53(圖 1中 Z6)與親本G0130，G0154的拮抗試驗，試驗結(jié)果顯示:雜交菌株與2個親本均能形成明顯的拮抗線，說明雜交菌株與2個親本都不同，產(chǎn)生了新的菌株。63株雜交菌株分別與其2個親本均有拮抗反應，說明獲得的63株雜交菌株確實是雜交菌株。

2.4 靈芝雜交菌株液態(tài)深層發(fā)酵菌絲生物量的測定

以雜交獲得的63株菌株為研究基礎，對其在發(fā)酵搖瓶中最終的菌絲體生物量進行分析，對獲得的63株菌株的生物量進行比較，結(jié)果如圖2所示。

表3 雜交菌株編號Table 3 The number of hybrid

圖1 雜交種與親本的拮抗實驗Fig.1 Antagonistic test of hybrids and parents

圖2 供試雜交菌株搖瓶發(fā)酵生物量Fig.2 Biomass of Ganoderma lucium hybrid strains from shaking flask fermentation

由圖2可知，在63株雜交菌株中，搖瓶發(fā)酵中菌絲體生物量最高的分別是雜29和雜62，生物量分別達1.85和1.83 g/L，較親本菌株G0119的1.55 g/L分別提高19.35%和18.06%，較親本菌株G0130的1.54 g/L分別提高20.12%和18.83%，較親本菌株G0154的1.39 g/L分別提高33.09%和31.65%。

2.5 雜29和雜62發(fā)酵特性的研究

雜29，雜62和親本菌株發(fā)酵特性的比較結(jié)果如圖3所示。圖3所示的是雜交菌株雜29和雜62發(fā)酵生產(chǎn)三萜過程中菌絲體生長、還原糖消耗、三萜合成，菌絲體比生長速率，葡萄糖比消耗速率和三萜比合成速率的變化曲線。

圖3 靈芝菌株菌絲體生長、底物消耗、三萜合成，比生長速率、比消耗速率和比合成速率的變化Fig.3 Time-courses of cell growth，glucose consumption，triterpenes formation，specific rate of cell growth，specific rate of glucose consumption and specific rate of triterpenes formation of Ganoderma lucidum

由圖3分析可知，在菌株生長過程中，雜29，雜62和親本菌株生長過程可以分為3個階段，發(fā)酵開始至20 h為靈芝菌株生長的初始階段;在20 h后菌株生長進入對數(shù)期，其中G0119和G0130的生長速度較快;在100至120 h菌株生長趨于穩(wěn)定，G0119、G0130、G0154、雜29和雜62的菌絲體含量分別為12.88，11.72，5.82，7.57 和5.26 g/L(如表4 所示)。在還原糖利用上，雜62對于還原糖的利用較差，G0119對還原糖的利用率最高。在發(fā)酵至120 h時，G0119、G0130、G0154、雜29 和雜62 對于還原糖底物的利用率分別為 99.73%，86.45%，58.70%，64.87%和11.09%(如表4所示)。在三萜產(chǎn)量上，在發(fā)酵至120 h 時，G0119、G0130、G0154、雜 29 和雜62合成三萜的含量分別為 17.88，27.46，15.44，37.02和33.83 mg/L，而其合成產(chǎn)物對菌絲體得率分別為0.340，0.363，0.265，0.316 和0.263 mg/100 mg(如表4所示)。

表4 靈芝菌株生產(chǎn)指標比較(120 h)Table 4 Results of production indexes of Ganoderma lucidum in 120 h

再由圖3分析可知，親本菌株 G0119、G0130、G0154以及雜交菌株雜29和雜62的比生長速率、比消耗速率和比合成速率利用Origin 8.5軟件中的Logistic模型進行擬合并求得其相對應的比速率曲線，結(jié)合表5中的擬合度(R2值)值分析可知，擬合的效果很好，均在95%置信區(qū)間以內(nèi)，因此，利用Logistic模型進行擬合是有效和可行的。與親本菌株G0119、G0130和G0154比較可知，雜29和雜62菌絲三萜產(chǎn)量高于親本菌株，而其比合成速率也高于親本菌株G0130;但是，雜29和雜62菌絲體產(chǎn)量在發(fā)酵培養(yǎng)基中卻低于親本菌株，雜29比生長速率卻高于親本菌株，雜29和雜62對于碳源的利用率也不如親本菌株，其中雜29的比消耗速率也較低，可能原因是本實驗所用的發(fā)酵培養(yǎng)基不是雜29和雜62雜交菌株的最適培養(yǎng)基，導致其對碳源的利用不高，也導致其菌絲體產(chǎn)量低于親本菌株，但是其菌絲體中三萜含量高于親本菌株，如對發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源進行優(yōu)化篩選，在適宜的條件下雜交菌株雜29和雜62的三萜產(chǎn)量可能更高。下一步試驗我們將對雜29和雜62的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

表5 靈芝菌株比生長速率、比消耗速率和比合成速率的擬合度Table 5 Fitting degree of specific rate of cell growth，specific rate of glucose consumption and specific rate of triterpenes formation of Ganoderma lucidum

3 結(jié)論

本文通過原生質(zhì)體單核化技術(shù)，獲得靈芝單核菌株。以單核菌株作為雜交育種材料，將篩選出的單核菌株進行兩兩配對，得到雜交菌株，并通過拮抗反應驗證。其中，針對同一菌株2種交配型單核菌株獲得比例的不同，香港中文大學的張樹庭［17］教授也報道了類似的情況，原生質(zhì)體2種交配型非等比例分配的原因，張教授認為是由于2種基因型的再生率的不同。南京農(nóng)業(yè)大學朱朝輝［18］教授在研究香菇原生質(zhì)體單核體再生與交配型的關系中進一步證實是不同原生質(zhì)體交配型再生能力的不同，而且發(fā)現(xiàn)2種交配型再生出來的時間會有較大的差異，一種集中在前期，另一種集中在后期。為了同時獲得2種交配型單核菌株應該加大挑取的數(shù)量并且注意挑取時間段的間隔性選擇。

用Logistic模型對靈芝雜交菌株菌絲體生長、葡萄糖消耗和三萜合成的比速率進行了計算與分析，主要結(jié)論總結(jié)如下:(1)通過雜交育種獲得了不同于親本的具有代表性的雜交菌株63株;(2)通過對雜交菌株的拮抗實驗驗證了雜交菌株不同于親本菌株;(3)通過液態(tài)深層發(fā)酵手段對雜交菌株產(chǎn)三萜活性物質(zhì)進行分析，比較于傳統(tǒng)的栽培方法更有效，更快捷;(4)通過動力學手段對其比生成速率，比消耗速率和比合成速率的分析，從理論上進一步說明了得到的雜交菌株雜29和雜62不同于且優(yōu)于親本菌株的性狀。

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