羅非魚魚皮膠原肽-葡萄糖美拉德反應產物的制備及其抗氧化活性*

劉蒙蒙，楊美智子，孫云，孫麗平，莊永亮

(昆明理工大學化學工程學院食品工程研究中心，云南昆明，650500)

近年來，開發食源性活性肽作為食品天然抗氧化劑已經成為研究熱點。但是食源性活性肽普遍存在味苦、抗氧化性能不全面的缺陷。Dong等［1］研究認為，美拉德反應(Maillard reaction，MR)可以掩蔽酪蛋白肽的苦味;Liu等［2］發現，大豆蛋白水解物的美拉德反應產物(Maillard reaction products，MRPs)表現高于水解物的還原能力、DPPH自由基清除活性和Fe2+螯合活性;Guerard等［3］研究表明，加熱酪蛋白胨和鱈魚內臟水解物與葡萄糖的混合物，加熱產物對自由基清除活性相比水解液本身提高了75%。

羅非魚(Oreochromis niloticus)是我國重要的經濟魚種，加工過程中產生了大量的皮、骨等副產物。前期的研究中制備了具有抗氧化活性的羅非魚魚皮膠原肽［4］。本文以前期制備的羅非魚魚皮膠原肽為原料，制備了不同條件下的膠原肽-葡萄糖的美拉德反應體系，對體系的pH值變化、MRPs在294 nm處的吸光值、褐變程度、熒光強度以及體系中游離氨基基團的含量進行了跟蹤測定，進一步對MRPs的抗氧化活性進行了分析，以期對不同條件下美拉德反應對羅非魚魚皮膠原肽的影響進行評價。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

未分級的羅非魚魚皮膠原肽由前期實驗制備［4］。

KW1000DC型數顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司;TDL－40B型離心機，上海安亭科學儀器有限公司;TU－1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;FE20實驗室pH計，梅特勒-托利多(上海)有限公司;RF－5310PC熒光分光光度計，日本島津公司。

1.2 不同條件下魚皮膠原肽-葡萄糖美拉德反應體系的制備

用0.2 mol/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液制備膠原肽溶液，濃度為25mg/mL，利用茚三酮比色法［5］測定溶液中游離氨基的摩爾濃度，以此濃度為基礎，加入葡萄糖，使體系中氨基與羰基的比例為1∶0.5、1∶1和1∶2，在后面的部分分別表示為 TSGP/G 1∶1，TSGP/G 1∶0.5，和 TSGP/G 1∶2。將溶液分別轉移至 25mL 螺旋密封管中(German Schott)，80℃的水浴加熱12 h，分別于 0，1，3，6，12h 取樣，立即冷卻，取部分 MRPs用于測定pH值和游離氨基濃度，其余MRPs保存于4℃下備用。不添加葡萄糖的TSGP作為對照試驗。

1.3 MRPs的光度分析

按照孫麗平等［6］的方法測定不同條件下MRPs的紫外吸光值、褐變強度和熒光強度。

1.4 美拉德反應產物的抗氧化活性的測定

1.4.1 DPPH·清除活性的測定

取0.4 mL不同反應體系的MRPs，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，混勻，暗處放置30 min并不斷振蕩，在517 nm處測其吸光度。0.4 mL水+2 mL甲醇為空白，0.4 mL蒸餾水代替樣品為對照。常用抗氧化劑Vc作為陽性對照。清除率計算公式為:

1.4.2 OH·清除活性的測定

取1.0 mL不同反應體系的MRPs，依次加入0.3 mL 8.0 mmol/L FeSO4溶液，0.25 mL 20 mmol/L H2O2溶液和1.0 mL 3.0 mmol/L水楊酸溶液，混勻，37℃水浴30 min，取出流水冷卻，加入0.45 mL蒸餾水，使體系最終保持3.0 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液于510 nm處測定吸光值。1.0 mL蒸餾水代替水楊酸溶液為樣品對照，1.0 mL蒸餾水代替樣品+1.0 mL蒸餾水代替水楊酸溶液為空白調零，1.0 mL蒸餾水代替樣品為對照。清除率計算公式為:

1.4.3 ABTS自由基清除活性的測定

將5 mL 7 mmol/L ABTS和88 μL 的140 mmol/L過硫酸鉀混合，在室溫，避光的條件下靜置12 h，形成ABTs·儲備液。該儲備液在室溫，避光的條件下穩定。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30℃下、734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02。

取0.5 mL不同反應體系的 MRPs，加入 4 mL ABTS·工作液充分混合10 s，30℃水浴6 min，于734 nm波長處測吸光度。0.5 mL無水乙醇+4 mL ABTS+·工作液，在0 min時的吸光值為對照，0.5 mL水+4 mL無水乙醇為空白調零。不同濃度的Trolox標準液(0，40，80，120，160 μmoL/L)繪制標準曲線。清除率計算公式為:

清除活性以Trolox當量表示。

1.4.4 還原能力的測定

取1.0 mL不同反應體系的MRPs，加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃水浴20 min，取出，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，迅速冷卻。取1.0 mL混合液于5.0 mL離心管中，加入1.0 mL超純水和0.2 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，測定溶液在700 nm處的吸光度(A700)。Vc作為陽性對照。蒸餾水代替樣品作為空白調零。以A700表示樣品的還原能力。

1.5 統計分析

每個試驗重復3次，結果表示為平均值±偏差。數據統計分析采用SPSS11.5軟件(P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著)。

2 結果和討論

2.1 pH值的變化

在美拉德反應中，pH值至關重要，因為羰氨縮合是一個可逆的過程，羰氨縮合過程中封閉了游離的氨基，反應體系pH值下降，所以堿性條件有利于初始的羰氨縮合反應［7］。本研究美拉德反應體系pH值變化如圖1所示。反應1h后，除TSGP外，所有體系的pH值均出現顯著的下降趨勢(P＜0.05)，隨后，pH值下降緩慢，直至反應結束。TSGP/G 1∶2中pH值下降幅度最大，表明較高的葡萄糖濃度產生相對較高的pH值降低，這一結果與王惠英等［8－9］的結果一致。美拉德反應中pH值的降低也可能是由于反應過程中產生了有機酸，如甲酸和乙酸［10］。

2.2 MRPs光度的變化

美拉德反應的小分子中間產物具有強紫外光吸收和熒光，294 nm光吸收是由糖裂解產生的酮、醛類等無色小分子物質產生的，美拉德體系中熒光強度與紫外光吸收強度的發展表現為不同的動力學行為，所以熒光小分子物質被認為是不同于具有紫外光吸收物質的小分子產物［6］。褐變強度(420 nm處的吸光值)是一個用于評價美拉德反應進程的非特定性參數，這主要是美拉德反應后期產生了高分子褐色化合物類黑素，其在420 nm處有最大特征性吸收［11］。本研究體系中MRPs在294 nm的吸光值(A294)、褐變強度和熒光強度的變化如圖2所示。隨加熱時間的增加，除TSGP外，所有美拉德反應體系的A294、褐變強度和熒光強度均顯著增加(P＜0.05)。

由圖2(a)可以看出，TSGP/G 1∶2體系的 MRPs的A294顯著高于 TSGP/G 1∶1和 TSGP/G 1∶0.5(P＜0.05)。加熱 12h后，TSGP/G 1∶2體系 MRPs的A294表現最大的增加值，其次是TSGP/G 1∶1和TSGP/G 1∶0.5。從本結果可以看出，美拉德反應中葡萄糖濃度越高，反應越快。同樣的，TSGP/G 1∶2體系的MRPs具有最大的褐變強度，隨后是TSGP/G 1∶1和TSGP/G 1∶0.5。童彥等［12］發現，隨著葡萄糖添加量的增加，420 nm處吸光值(褐變強度)不斷增加，說明葡萄糖不斷參與美拉德反應，褐色物質不斷生成，反應程度持續加深。從結果可以看出，所有樣品的褐變強度隨A294的增加而增加。一般來說，中間階段的紫外吸收和無色化合物引起美拉德反應和焦糖化反應中褐色色素的形成［13］。在任一反應時間點，TSGP/G 1∶2的熒光強度均大于TSGP/G 1∶0.5和TSGP/G 1∶1，與A294和褐變強度的變化趨勢相似。美拉德反應中熒光化合物的形成先于褐色色素的產生［14］。熒光化合物可能是褐色色素的前體［15］。

圖2 MRPs在294nm下的吸光值(a)、褐變強度(b)和熒光強度(c)隨加熱時間的變化Fig.2 Changes in absorbance at 294 nm(a)，browning intensity(b)and fluorescence intensity(c)of MRPs as function of heating time

2.3 游離氨基濃度的變化

美拉德反應體系中游離氨基濃度隨加熱時間的變化如圖3所示。反應3 h內，含有不同濃度葡萄糖的TSGP-G體系中游離氨基的濃度顯著下降(P＜0.05)，隨后，隨加熱時間的增加，各體系中游離氨基的含量出現不同程度的變化，TSGP/G 1∶2體系中MRPs的游離氨基含量隨加熱時間的增加而持續降低。加熱12 h 后，TSGP/G 1∶0.5，TSGP/G 1∶1和 TSGP/G 1∶2體系中減少的游離氨基含量分別為23.60%，25.62%和33.11%。單獨加熱的TSGP中游離氨基含量也隨加熱時間的增加而減少，但不明顯。結果表明，葡萄糖濃度越高，參與反應的游離氨基含量越多，即美拉德反應越能高效地發生。此結果與Dong等［1］的結果一致。另外，游離氨基含量的降低與A294和褐變強度的增加(圖2)存在正相關性。Zeng等［16］也發現游離氨基基團的損失和褐變程度之間存在相關性。

圖3 反應體系中游離氨基含量隨加熱時間的變化Fig.3 Changes in free amino group content of Maillard reaction system as function of heating time

2.4 美拉德反應產物的抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除活性

MRPs對DPPH·的清除活性隨加熱時間的變化如圖4(a)所示。TSGP具有相對較低的DPPH·清除活性，并且不受加熱時間的影響(P＞0.05)。加熱6h內，所有MRPs的DPPH·清除活性均顯著增加(P＜0.05)。加熱至12h 時，TSGP/G 1∶0.5，TSGP/G 1∶1和TSGP/G 1∶2的活性分別達到88.97%，94.61%和95.17%，相當于11.11～11.86 μg/mL的常見抗氧化劑Vc。本研究中，TSGP/G 1:2體系中的 MRPs的DPPH·清除活性在各加熱時間點均高于TSGP/G 1∶0.5和TSGP/G 1∶1，這說明，美拉德反應體系中葡萄糖濃度越高，產生的MRPs的自由基清除活性越高。這一結果與王惠英等［8］的結果一致。有學者報道，褐變強度與DPPH·清除活性相關［7］。

2.4.2 羥自由基清除活性

如圖4(b)所示，隨加熱時間和葡萄糖濃度的變化，MRPs的羥自由基清除活性無顯著差異(P＞0.05)。這一現象可能是由于MRPs的金屬螯合活性［17－18］。MRPs的螯合能力取決于其濃度以及體系中的金屬，金屬濃度越高，MRPs結合位點飽和，從而干預了它進一步的抗氧化能力［19－20］。因此，在羥自由基清除活性中，MRPs的金屬螯合能力干預了其羥自由基清除活性。在Vhangani等［10］的研究中，核糖-賴氨酸和果糖-賴氨酸模擬體系MRPs的羥自由基清除活性無顯著差異，與本實驗結果一致。

2.4.3 ABTS自由基清除活性

由如圖4(c)可以看出，所有MRPs的ABTS自由基清除活性均隨加熱時間的增加而顯著增加(P＜0.05)。且TSGP/G 1∶2表現最高的清除活性，其次為TSGP/G 1∶1，TSGP/G 1∶0.5 的活性較低，但仍高于單獨加熱的TSGP對照組的活性。TSGP/G 1∶0.5，TSGP/G 1∶1和 TSGP/G 1∶2加熱 12 h 得到的 MRPs的 ABTS自由基活性分別為 148.82，164.32和176.03 μmol/mL Trolox當量。MRPs的ABTS自由基清除活性與DPPH自由基清除活性［圖4(a)］表現相似的趨勢。Zeng等［16］也發現，MRPs具有ABTS自由基清除活性，且清除活性隨反應時間的增加而增加。

2.4.4 還原能力

由圖4(d)可知，隨著反應時間的增加，各體系MRPs的還原能力也隨之增加，TSGP/G 1∶2體系中MRPs的還原能力增強的最為明顯，加熱至6 h時還原能力已相當于145.03 μg/mL Vc。而對照組TSGP的還原性沒有隨反應時間的增加而增加。Zeng等［16］也報道，在整個美拉德反應過程中，MRPs的還原能力隨反應時間的增加而增加。

圖4 MRPs的DPPH·(a)、OH·(b)和ABTS+·(c)清除活性以及還原能力(d)隨加熱時間的變化Fig.4 Changs of DPPH radical(a)，hydroxyl radical(b)and ABTS radical(c)scavenging activities，and reducing power of MRPs as function of heating time

3 結論

結果表明，羅非魚魚皮膠原肽-葡萄糖的美拉德反應是一個酸度和褐變不斷增強的反應過程。在相同反應條件下，TSGP/G 1∶2體系美拉德反應產物的褐變強度、熒光強度、自由基清除活性、還原能力均強于 TSGP/G 1∶0.5 和 TSGP/G 1∶1體系的 MRPs。同時，除羥自由基清除活性外，羅非魚魚皮膠原肽的美拉德反應產物的抗氧化活性均顯著優于膠原肽。

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