rhGM-CSF及納米銀對深Ⅱ度燙傷創面愈合過程血管化的影響*

楊景哲,溫海玲,耿琪瑛,陳鳳平,馮欣姝

(承德醫學院附屬醫院燒傷整形科,承德 067000)

rhGM-CSF及納米銀對深Ⅱ度燙傷創面愈合過程血管化的影響*

楊景哲,溫海玲,耿琪瑛,陳鳳平,馮欣姝

(承德醫學院附屬醫院燒傷整形科,承德 067000)

目的 研究外用重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和納米銀敷料外用,對深Ⅱ度燙傷創面組織愈合及血管化的影響。方法用Wistar大鼠建立深Ⅱ度燙傷模型,分為A、B、C組。A組(n=30):凡士林紗布覆蓋,B組(n=30):納米銀敷料覆蓋,C組(n=30):rhGM-CSF涂抹創面。傷后第1,4,7,10,14,21天,觀察創面病理學改變,按照酶聯免疫吸附法測定血清中血管內皮生長因子(VEGF)水平,采用實時-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法,檢測創面愈合過程中缺血壞死因子-1α(HIF-1α)mRNA表達的變化。結果病理學改變:A、B、C組均在第10天出現明顯的血管化;創面愈合率:C組＞B組＞A組,第14天、第21天時,組間差異有統計學意義(P＜0.05)。VEGF水平:傷后第1天3組間差異無統計學意義(P＞0.05),第4,7,10,14天3組間及第21天A組和C組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。HIF-1αmRNA相對表達量:A組第14天達峰值,B組、C組逐漸增大,第10天達峰值,隨后下降,且C組下降幅度最明顯,第1天A組與B組、C組之間差異有統計學意義(P＜0.05),第4天,3組間差異無統計學意義(P＞0.05),第7天A組與C組之間及第10,14,21天各組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論rhGM-CSF和納米銀外用,促進深Ⅱ度燙傷創面愈合過程中血管化的形成,并且rhGM-CSF血管化程度優于納米銀。

重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子;納米銀;燙傷創面;血管內皮生長因子;缺血壞死因子

燙傷創面外用敷料的研究,尤其是對于深Ⅱ度創面,是目前的燙傷研究的熱點,重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rhGM-CSF)是基因工程產物,外用rhGM-CSF主要通過適度炎癥反應、促進角化上皮細胞增殖以及促進局部新生血管形成等機制發揮促進創面愈合作用[1]。納米銀敷料主要通過抗感染作用加速創面愈合,其促進創面愈合的作用已經被充分證實[2]。本研究旨在通過建立深Ⅱ度燙傷大鼠模型,研究外用rhGM-CSF及納米銀對缺血壞死因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)mRNA和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達的影響,探討二者在促進血管化方面的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 Wistar大鼠,SPF級,90只,體質量200～220 g,雌雄各半,由天津山川紅實驗動物科技有限公司購買,動物許可證號:SCXK(津)2009-0001。大鼠于實驗室條件下的動物房內,溫度(24±3)℃,常規配方飼料喂養和自來水飲水,按照國家衛生實驗動物護理和使用指南進行。水合氯醛1 mL·kg-1腹腔注射麻醉,背部去毛后用99℃紗布覆蓋10 s,造成約4 cm× 4 cm深Ⅱ度燙傷創面(病理切片證實),傷后創面分別用A、B、C 3種方法處理,每組30只。A組:凡士林紗布覆蓋;B組:0.9%氯化鈉溶液濕潤納米銀醫用抗菌敷料(深圳市愛杰特醫藥科技有限公司)覆蓋,A組、B組敷料完全覆蓋創面即可;C組:rhGM-CSF(長春金賽藥業有限公司)涂抹創面,每次涂抹約2 g。A組、B組、C組大鼠創面每天換藥,分別于傷后第1,4,7,10, 14,21天留取皮膚標本1 cm×1 cm,留取血標本一份約3 mL,至第21天,終止實驗。

1.2 創面病理觀察 創面換藥時分別于傷后第1,4, 7,10,14,21天觀察各組創面炎癥反應情況,創面組織標本在蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色情況下觀察細胞浸潤、血管通透性、炎細胞趨化及血管化程度。

1.3 創面愈合率計算 創面攝相,計算創面愈合面積,計算創面愈合率。創面愈合率(%)=(創面總面積-殘余創面面積)/創面總面積×100%。

1.4 VEGF檢測 血清標本解凍,按照酶聯免疫吸附法測定各標本血清中VEGF水平,試劑盒購買自武漢華美生物工程有限公司,按照說明書操作。

1.5 HIF-1αmRNA水平的檢測 將組織標本加入Trizol,用Trizol總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA,經紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度,重復測定3次,A260和A280之比值應在118～210,計算樣品總RNA濃度。引物序列為:HIF-1αcDNA擴增的上游引物5′-AACAAACAGAATCTGTCCTCAAACC-3′,下游引物5′-CAGGTAATGGAGACATTGCCAG-3′,產物片段長度為296 bp;β-actic上游引物5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′,下游引物5′-ACTCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,擴增片段長度220 bp。取總RNA 1μg,加入Oligo(dT)18 Primer,70℃溫育5 min;迅速放入冰浴中,加入10mmol·L-1dNTP,RNA酶抑制劑,5×緩沖液,42℃溫育5 min;冰浴中加入5 U·μL-1AMV逆轉錄酶,加入DEPC處理水至總體積20μL, 42℃溫育60 min,70℃10min,立置冰上,-80℃冰箱保存備用。將反應管置于PCR(美國MJ公司PTC-220)儀上,95℃預變性10 min后,進入95℃變性1 min,50℃退火15 min,72℃延伸10 min的循環,共34次,最后72℃充分延伸10 min。反應完成后取PCR反應液10μL,經1%瓊脂糖凝膠電泳,用PCRMarker作分子量標準。電泳完畢后在紫外熒光數字成像儀下觀察結果。以每只大鼠HIF-1α與β-actin擴增產物條帶吸光度的比值作為HIF-1αmRNA的相對表達量。

1.6 統計學方法 運用SPSS16.0版統計軟件進行統計學分析。F檢驗比較創面愈合率及VEGF、HIF-1α mRNA相對表達量在同時間點各組的差異,SNK-q檢驗比較同時間點組內兩兩比較的差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 創面病理學表現 A、B、C 3組均在第10天出現明顯的血管化,A組創面傷后紅腫明顯,切片可見大量炎性細胞浸潤、聚集、遷移,血管壁通透性增加,血管化程度不高(圖1A);B組創面傷后紅腫,在傷后第4天炎癥反應最重,切片可見炎性細胞浸潤、聚集、遷移,血管壁通透性增加,血管化程度較A組加快,至第14天因為創面溶痂,炎癥反應較前略有加重(圖1B);C組創面傷后紅腫,較A、B組明顯減輕,切片可見適量炎性細胞浸潤、聚集、遷移,血管壁通透性增加,血管化進程最快(圖1C)。

2.2 創面愈合率 在傷后第1,4,7天各組創面均未出現愈合,第10,14,21天創面愈合率C組＞B組＞A組。第10天,3組之間差異無統計學意義(P＞0.05);第14,21天,3組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 血清VEGF水平 A組VEGF水平在燙傷后一直逐漸上升,B組、C組逐漸上升,第14天達到峰值,第21天水平下降,可能與B組、C組第21天創面溶痂完成,局部微循環改善有關,血管化程度降低,尤其是C組下降幅度最大。VEGF水平在第1天各組間差異無統計學意義(P＞0.05),第4,7,10,14天各組間差異有統計學意義(P＜0.05),第21天,A組、C組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.4 HIF-1αmRNA的相對表達量 HIF-1α與βactin擴增產物均顯示為清晰的條帶。HIF-1α與βactin條帶吸光度的比值作為HIF-1αmRNA相對表達量,結果顯示,HIF-1αmRNA相對表達量,A組持續增大,第14天達峰值,B組、C組逐漸增大,第10天達峰值,隨后逐漸下降,可能與創面溶痂快慢、局部壞死組織脫落程度及缺血、缺氧程度有關,且C組下降幅度最明顯。第1天A組與B組、C組之間差異有統計學意義(P＜0.05),第4天,3組間差異無統計學意義(P＞0.05),第7天A組與C組之間差異有統計學意義(P＜0.05),第10,14,21天3組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

3 討論

A.A組;B.B組;C.C組圖1 3組大鼠燙傷后第14天創面血管化情況(HE染色,×200)A.group A;B.group B;C.group CFig.1 Vascularization of wound surface in three groups of rats 14 days after burn(HE staining,×200)

表1 3組大鼠不同時間點愈合率比較Tab.1 Healing rate of three groups of rats at different time points %

正常的燙傷創面愈合要經歷肉芽生成、血管新生、膠原沉積和組織重塑等階段,而創傷中的新生血管為其提供營養物質和細胞因子以及排出代謝產物[3-4]。燙傷發生后創面缺血、缺氧致使HIF-1α表達升高,進而上調VEGF,VEGF能促進血管生成,改善局部微循環,從而加速創面愈合過程。rhGM-CSF作為組織工程產物,能趨化中性粒細胞、巨噬細胞、VEGF、HIF-1α、表皮生長因子、血小板衍生生長因子等活化或表達,一方面,控制創面炎癥反應,而臨床治療中多直接選擇復方環丙沙星[5]等抗菌藥物對抗創面炎癥反應,另一方面,啟動細胞因子,加速局部血管化程度,改善微循環,進而促進創面愈合[6],并且在燙傷殘余創面治療上有獨特的優勢[7]。納米銀敷料是采用納米技術,將單質銀制成粒徑約為25 nm的銀微粒,銀離子的緩慢釋放使其具有持續殺菌、減輕創面感染的特點,燙傷創面可分泌大量基質金屬蛋白酶,不利于創面的愈合,而納米銀抑制基質金屬蛋白酶的作用促進了創面的愈合[8]。本研究結果提示,創面治愈率C組最快,A組最慢,在第10天,A組、B組、C組之間差異無統計學意義(P＞0.05),考慮為深Ⅱ度燙傷創面修復剛開始啟動,各組自身優勢相比不明顯,第14,21天,A組、B組、C組之間差異有統計學意義(P＜0.05),證明B組、C組在促進創面愈合方面較A組有明顯優勢,并且rhGM-CSF比納米銀敷料在加速創面愈合方面作用更加突出。

深Ⅱ度燙傷發生后,皮膚及皮下毛細血管網在熱力作用下損傷或栓塞,使組織局部缺血缺氧。缺血缺氧是誘導血管新生因子釋放的最主要因素[9],低氧分壓可誘導VEGF mRNA的表達[10]。VEGF是HIF-1α的一個重要靶基因,也是血管生成的主要調節因子[11],在缺氧條件下,VEGF能被HIF-1α誘導而轉錄激活,尤其是各種組織細胞在創傷及血管新生過程中。

VEGF是目前已知的一種最強的血管生成因子,其在正常組織中合成水平很低,但在外傷愈合過程VEGF可高表達[12],主要通過新生血管作用調節局部組織血管結構變化,以及血管源性水腫等生理、病理過程[13]。在病理及生理的血管生成中都是必不可少的誘導因子,其高效特異地作用于血管內皮細胞,有強烈的促分裂和趨化作用,形成血管萌芽和管腔,并可增強微血管通透性,誘導新血管形成[14]。本研究結果提示,A組VEGF水平在燙傷后一直逐漸上升,B組、C組逐漸上升,上升趨勢較A組明顯,第14天達到峰值,第21天水平下降,可能與B組、C組第21天創面溶痂完成,大部創面愈合,局部組織缺血缺氧逐漸改善,血管化程度有所降低有關,C組尤然。VEGF水平在第1天各組間差異無統計學意義(P＞0.05),說明燙傷早期創面發生應激性反應,機體修復機能未完全啟動;第4, 7,10,14天各組間及第21天A組與C組之間差異有統計學意義(P＜0.05),在促進創面血管化方面,B組、C組優于A組,并且C組優于B組,即rhGM-CSF在促進深Ⅱ度燙傷創面血管新生方面有優勢。

表2 3組深Ⅱ度燙傷大鼠血液VEGF水平Tab.2 Serum level of VEGF in three groups of rats with deepⅡdegree burn pg·mL-1,±s

表2 3組深Ⅱ度燙傷大鼠血液VEGF水平Tab.2 Serum level of VEGF in three groups of rats with deepⅡdegree burn pg·mL-1,±s

與A組同時間點比較,*1P＜0.05,與B組同時間點比較,*2P＜0.05Compared with group A at the same time point,*1P＜0.05;compared with group B at the same time point,*2P＜0.05

組別大鼠/只第1天第4天第7天第10天第14天第21天A組30 23.01±1.73 23.18±1.64 23.55±1.48 20.81±1.43 19.54±1.07 25.76±1.46 B組30 23.09±1.10 24.61±1.25*126.38±1.13*127.05±1.37*129.73±1.58*126.27±2.10 C組30 23.23±1.66 25.43±1.41*1*230.81±1.44*1*233.47±1.26*1*238.91±2.38*1*227.11±1.91*1

表3 3組深Ⅱ度燙傷大鼠創面H IF-1αm RNA相對表達量水平Tab.3 Relative expression of HIF-1αmRNA in wound surface of three groups of rats with deepⅡdegree burn ±s

表3 3組深Ⅱ度燙傷大鼠創面H IF-1αm RNA相對表達量水平Tab.3 Relative expression of HIF-1αmRNA in wound surface of three groups of rats with deepⅡdegree burn ±s

與A組同時間點比較,*1P＜0.05,與B組同時間點比較,*2P＜0.05Compared with group A at the same time point,*1P＜0.05;compared with group B at the same time point,*2P＜0.05

組別大鼠/只第1天第4天第7天第10天第14天第21天A組30 2.18±0.21 2.35±0.22 3.29±0.50 4.87±0.38 6.36±0.56 5.72±0.45 B組30 2.30±0.10*12.41±0.13 3.21±0.37 4.23±0.41*14.17±0.26*13.43±0.23*1C組30 2.28±0.17*12.44±0.15 3.01±0.33*13.78±0.22*1*23.57±0.19*1*22.75±0.32*1*2

HIF-1α是缺氧的特異感受因子,其基本作用是對缺氧產生適應性反應,反應細胞缺氧狀態,調節氧平衡,通過轉錄活化編碼VEGF基因[15],誘導VEGF的表達,從而促成血管新生。本研究結果提示,HIF-1α mRNA相對表達量,A組于傷后第14天出現高峰,第21天出現下降,而B、C組第10天出現高峰,第14天開始下降,可能與創面溶痂快慢、局部壞死組織脫落程度及缺血、缺氧程度有關,創面局部新生血管生成后使氧平衡得到改善,因此HIF-1α及其調控因子VEGF的表達相應下調[16-17]。第1天A組與B組、C組之間差異有統計學意義(P＜0.05),可能與rhGM-CSF和納米銀外用,趨化性的啟動機體應激性反應,傳遞細胞信號,啟動修復機制;第4天,A組損傷機制的啟動,使差異無統計學意義;第10,14,21天各組間差異均有統計學意義(P＜0.05),證明rhGM-CSF和納米銀在促進創面溶痂,啟動血管生成,改善局部缺血、缺氧,加速創面血管化方面比凡士林有明顯優勢,并且,rhGM-CSF比納米銀有優勢。HIF-1α促進創面血管化機制可能與蛋白激酶C及磷脂酰肌醇激酶活化有關[18],啟動HIF-1α轉錄,上調VEGF的表達,刺激血管新生。相關研究認為,HIF-1α通過誘導VEGF基因轉錄產生既能使缺氧細胞存活,改善微循環,完善供氧系統,又通過誘導P53等基因表達,促使細胞凋亡,降低耗氧量[19]。

燙傷創面外用敷料的研究逐漸趨向復合生物材料,rhGM-CSF和納米銀敷料外用均能改善深Ⅱ度燙傷創面血管化程度,但是rhGM-CSF優勢更加明顯。能否將二者聯合應用,充分利用凝膠保濕和納米銀敷料的敷料架構作用,其相關發生機制需要進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.008

Effect of Recombinant Human Granulocyte/macrophage Colony-stimulating Factor and Nano-silver on Neovascularization in Healing Process of Skin with DeepⅡDegree Burn

YANG Jing-zhe,WEN Hai-ling,GENG Qi-ying,CHEN Feng-ping,FENG Xin-shu
(Department of Burns and Plastic Surgery,Affiliated Hospital ofChengde Medical College,Chengde 067000,China)

Objective To observe the effect of recombinant human granulocyte/macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF)and nano-silver as treatment for skin with deepⅡdegree burn.MethodsDeepⅡdegree burn Wistar rat model was established.The rats were randomly divided into three groups,petrolatum treatment group(group A,n=30),nanosilver treatmentgroup(group B,n=30),and rhGM-CSF treatmentgroup(group C,n=30).The pathological changes ofwound of the three groupswere observed 1,4,7,10,14 and 21 days after the treatment.The concentration of VEGF in serumswasmeasured with ELISA.The levels of HIF-1αmRNA expression were detected by RT-PCR.ResultsOn day 10,neovascularization developed in groups A,B and C.Healing rate of the wound was the highest in group C,lowest in group A,with significant differences among the three groups on day 14 and day 21(P＜0.05).VEGF level peaked on day 14 in group A,and on day 10 in groups B and C.There were significant differences in VEGF level on day 1 between group A and groups B,C,on day 7 between group A and group C,on day 10,14 and 21 among the three groups(P＜0.05),but no significant differences on day 4 among the three groups.ConclusionrhGM-CSF and nano-silver treatment can accelerate neovascularization of wound,and rhGM-CSF is better than nano-silver.

Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor;Nano-silver;Burn wound;Vascular endothelial growth factor;Hypoxia inducible factor

R986;R644

A

1004-0781(2014)12-1570-05

2013-12-23

2014-06-11

*河北省2013年醫學科學研究重點課題計劃指令性課題(20130024);承德市科學技術研究與發展計劃項目(20122164)

楊景哲(1980-),男,河北承德人,主治醫師,碩士,主要從事燒傷創面愈合機制研究。電話:0314-2279277,E-mail:sanyue_1@sina.com。

耿琪瑛(1954-),女,河北承德人,主任醫師,教授,學士,研究方向:燒傷難愈性創面治療及異體皮臨床應用。電話:0314-2279276,E-mail:sanyue_1@aliyun.com。