高效液相色譜法測定人血漿中去鐵酮含量*

陸華，程道海，雷小光，何云燕，萬瑞融，蘇明，吳克婕，羅建明

(廣西醫科大學第一附屬醫院 1．藥學部；2．兒科，南寧 530021；3．桂林醫學院藥學本科2009級，桂林 541004)

高效液相色譜法測定人血漿中去鐵酮含量*

陸華1，程道海1，雷小光1，何云燕2，萬瑞融1，蘇明1，吳克婕3，羅建明2

(廣西醫科大學第一附屬醫院 1．藥學部；2．兒科，南寧 530021；3．桂林醫學院藥學本科2009級，桂林 541004)

目的建立高效液相色譜法測定人血漿中去鐵酮(DFP)含量。方法Kromasil C18色譜柱(4.6 mm× 200 mm,5μm),流動相:乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀(含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉,1%三乙胺)＝11∶89(用磷酸調至pH1.3),檢測波長:278 nm,柱溫:25℃,進樣量:20μL,流速:1mL·min-1。結果DFP在0.5～80.0 mg·L-1濃度范圍內線性良好(r＝0.996 5),最低檢出濃度為0.5 mg·L-1。高、中、低3種濃度樣品絕對回收率>85.6%,方法回收率>89.9%,日內精密度RSD在1.61%～3.70%,日間精密度RSD在1.84%～4.81%。結論該方法操作簡便易行,快速準確,靈敏度高,專屬性強,適用于DFP的人體血漿濃度測定。

去鐵酮；人體血漿；色譜法,高效液相；含量測定

去鐵酮(deferiprone,DFP),化學名稱3-羥基-1,2-二甲基-4-(1H)-吡啶酮(3-hydroxy-1,2-dimethylpyridin-4(1H)-one),分子式:C7H9NO2,為口服的二齒狀金屬螯合劑,臨床上常用于治療耐受或不愿意接受現有螯合劑治療的鐵負荷過多的β地中海貧血［1］。β地中海貧血為廣西常見的兒童遺傳性血液病,臨床上表現為慢性血管外溶血,重型死于貧血及含鐵血黃素沉著癥［2］。因此有必要通過檢測患兒體內去鐵酮血藥濃度來指導臨床合理用藥。目前,國內文獻只有采用高效液相色譜法測定動物血漿中DFP含量的報道［3-6］,筆者尚未見有關建立人體血漿的DFP含量測定方法的報道。本實驗建立適用于人體血漿DFP藥物濃度檢測的高效液相色譜-紫外檢測法,方法具有操作簡便、快速準確、靈敏度高、專屬性強的特點,并在服藥患者身上得到驗證。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 DFP對照品(海南希源化工科技有限公司,批號:1101002,規格:5 g,含量99.1%)；內標物:替硝唑(中國食品藥品檢定研究院,批號:100336-200402,純度:100%)；健康人空白血漿(南寧市中心血站)；乙腈(色譜純,天津市永大化學試劑開發中心)；磷酸二氫鉀(分析純,成都市科龍化工試劑廠)；庚烷磺酸鈉(分析純,天津市大茂化學試劑廠)；三乙胺(分析純,成都市科龍化工試劑廠)；磷酸(分析純,汕頭市光華化學廠)。硫酸鋅(分析純,廣州化學試劑廠)；甲醇(色譜純,天津市大茂化學試劑廠)。

1.2 儀器 LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-6AV UV-VIS檢測器(日本島津公司)；N2000雙通道色譜工作站(浙江大學智達信息工程有限公司)；DF110電子分析天平(江蘇常熟衡器廠)；PHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)；XW-80A渦旋混合器(上海醫科大學儀器廠)；H.H.S電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械五廠)；TDXFLX75003530/02高速離心機(美國雅培公司)；TF-50溶劑過濾器(天津市津騰實驗設備有限公司)；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；SB2200超聲儀(上海BRANSON公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm× 200 mm,5μm)；流動相:乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀(含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉、1%三乙胺)＝11∶89 (用磷酸調pH至1.30)；檢測波長278 nm；柱溫25℃；進樣體積20μL；流速1.0 mL·min-1。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照溶液制備 精密稱取DFP對照品(含量99.1%)0.100 6 g置于50 mL量瓶,用去離子水溶解并稀釋至刻度,配制成濃度為1 994 mg·L-1的DFP對照品儲備液。配制成的溶液置4℃冰箱保存備用。

2.2.2 內標溶液制備 精密稱取內標物替硝唑0.008 4 g置于5 mL量瓶,用去離子水溶解并稀釋至刻度,配制成濃度為1 680 mg·L-1的替硝唑內標溶液。配制成的溶液置4℃冰箱保存備用。

2.2.3 沉淀劑制備 稱取硫酸鋅30.0 g于100 mL量瓶,用去離子水溶解并稀釋至刻度,配制成30%硫酸鋅溶液作沉淀劑。配制成的溶液置4℃冰箱保存備用。

2.3 血樣處理 取血漿425μL,加內標儲備液25μL,混勻后加入沉淀劑50μL,置于1.5 mL離心管,渦旋振搖1 min,置50℃水浴鍋中保溫10 min,冷卻,10 900 r·min-1離心5 min,取上清液按“2.1”項進樣,記錄色譜圖。

2.4 方法驗證 取DFP對照溶液和內標溶液各25μL,加適量純化水混勻,配制成A液500μL；取DFP對照溶液、內標溶液各25μL,沉淀劑50μL,加適量純化水混勻,配制成B液500μL；取沉淀劑50μL,加適量健康人空白血漿混勻,配制成C液500μL；取DFP對照溶液、內標溶液各25μL,沉淀劑50μL,加適量健康人空白血漿混勻,配制成D液500μL。A、B、C、D液按“2.3”項的“渦旋振搖1 min,置50℃水浴鍋中保溫10 min,冷卻,10 900 r·min-1離心5 min,取上清液按“2.1”項進樣得色譜圖(圖1)。結果圖1A顯示DFP和內標在該色譜條件下峰形良好,能有效分離,保留時間控制在10 min內；圖1C,圖1D顯示血漿中成分對DFP和內標測定無干擾；比較圖1A、圖1B的DFP的峰面積,以及與內標峰面積進行比值,無明顯差異,說明加入的沉淀劑(30%硫酸鋅)對含量測定結果無干擾。

圖1 DFP高效液相色譜圖A.純化水加DFP、內標(替硝唑);B.純化水加DFP、內標、沉淀劑;C.空白血漿加沉淀劑;D.空白血漿加DFP、內標、沉淀劑;1.DFP;2.替硝唑Fig.1 HPLC Ch romatogramof DeferiproneA.distilled water spiked with deferiprone and reference substance(tinidazole);B.distilled water spiked with deferiprone、reference substance and precipitant;C.blank plasma spiked with precipitant;D.blank plasma spiked with deferiprone、reference substance and precipitant;1.deferiprone;2.tinidazole

2.5 標準曲線制備 按“2.3”項操作取DFP對照品儲備液(濃度為1 994 mg·L-1),用健康人空白血漿稀釋成含0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,40.0,80.0 mg·L-1的各系列濃度,進樣并記錄DFP和內標峰面積,并將其比值(Y)與各對應的DFP濃度(X,mg·L-1)作線性回歸分析,得標準曲線方程:Y＝0.027 7X+0.019 3,r＝0.996 5,結果表明,DFP濃度在0.5～80.0 mg·L-1范圍內線性良好,定量下限為0.5 mg·L-1。

2.6 準確度與回收率實驗 分別取濃度為1.0, 20.0,80.0mg·L-1的DFP對照品系列水溶液(含定量內標替硝唑84.0 mg·L-1)直接進樣,得低、中、高濃度對照品的DFP與內標峰面積比值(Y0)；再按“2.3”項操作取DFP對照品儲備液用健康人空白血漿稀釋成濃度為1.0,20.0,80.0 mg·L-1(C0)的對照品系列血漿,上清液按“2.1”進樣,得DFP和內標峰面積比值(Yt),比值Yt代入標準曲線方程計算DFP的濃度Ct,以Yt/Y0×100%計算即得血漿樣本處理的絕對回收率,以Ct/C0×100%計算即得血樣處理的方法回收率。結果見表1。

表1 DFP回收率實驗結果(n=5)Tab.1 Recovery of Deferiprone(n=5) %,±s

表1 DFP回收率實驗結果(n=5)Tab.1 Recovery of Deferiprone(n=5) %,±s

濃度/ (mg·L-1)絕對回收率RSD方法回收率RSD 1.0 93.6±5.24 5.60 107.2±3.22 3.00 20.0 85.6±1.61 1.88 89.9±1.43 1.59 80.0 90.8±1.88 2.07 96.9±2.37 2.45

2.7 精密度實驗 按“2.3”項下操作取DFP對照品儲備液用健康人空白血漿稀釋成濃度為1.0,20.0, 80.0 mg·L-1的對照系列血漿,上清液按“2.1”項色譜條件進樣,各濃度于1 d內測定5次和每日測定1次,連續測定5 d。結果見表2。

表2 DFP精密度實驗結果 (n=5)Tab.2 Precision of Deferiprone (n=5)

2.8 專屬性 分別取含有丙戊酸鈉、卡馬西平、環孢素A、甲氨蝶呤的患兒血漿,按“2.3”項血樣處理操作后按照色譜條件進樣；之后平行加入DFP溶液(濃度為399.2 mg·L-1)25μL,按“2.3”項血樣處理操作后按照色譜條件進樣,考察4種臨床兒科常用藥物對DFP含量測定的色譜條件影響,結果表明這些藥物在該色譜條件下對人體血漿DFP含量測定無干擾。

2.9 β-地中海貧血患兒服用DFP 2 h后測定DFP血藥濃度 患兒(男)按25 mg·kg-1一次頓服去鐵酮片(加拿大Apotex公司,規格:每片0.5 g),服藥后2 h取血漿,按“2.3”項血樣處理操作,得色譜圖(圖2),測得患兒DFP血漿濃度為4.8 mg·L-1。

3 討論

圖2 患者血漿高效液相色譜圖1.DFP;2.替硝唑Fig.2 HPLC chromatography of patient plasma1.deferiprone;2.tinidazole

對于流動相的篩選,參考文獻［3-8］并結合實驗,最終確定以乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀(含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉、1%三乙胺)＝11∶89為流動相,其中選擇的庚烷磺酸鈉能與DFP形成離子對形式,消除DFP峰拖尾現象［3］；文獻提供的流動相中加入乙二胺四乙酸試劑［3-8］,筆者在本研究也實驗過,但均產生峰形拖尾,最后更換為三乙胺；流動相的pH為3［3-8］條件下,峰形拖尾較嚴重,當在酸性更高條件下,特別調整到pH為1.3時,能較好地解決DFP峰拖尾問題,且血漿雜峰對測定無干擾,內標峰與DFP峰均獲得理想的保留時間,所以本實驗流動相pH確定為1.3,色譜柱選用耐酸性好的Kromasil C18柱。

根據文獻［3-6］報道DFP在紫外波長278 nm處有強的吸收峰,且能減少流動相和血漿對DFP峰的干擾,所以本研究采用該波長作為檢測波長；通過篩選咖啡因［9］、甲硝唑［5］等化合物,最終確定峰形良好、保留時間適合的替硝唑作為內標物質。

實驗過程選擇乙腈作為蛋白沉淀劑,但處理后DFP峰形仍出現拖尾。改用30%硫酸鋅做蛋白沉淀劑,DFP峰和內標峰峰形理想,對測定結果無影響。

通過測定1例β-地中海貧血患兒服用DFP后的血藥濃度證實該方法的可行性。本方法操作簡便易行,快速準確,靈敏度高,專屬性強,適合用于臨床上測定人體血漿中DFP的含量。

［1］李曉.鐵螯合劑治療的新進展[J].世界臨床藥物,2007, 28(8):479-481.

［2］胡修英,王碧玉.除鐵靈治療兒童鐵負荷過重疾病療效觀察[J].醫藥導報,1996,15(5):232-233.

［3］鞏泉泉,劉萍,徐華雷,等.HPLC法測定大鼠血漿中去鐵酮的含量[J].藥物分析雜志,2010,30(2):271-274.

［4］鞏泉泉,劉萍,張雅楠,等.去鐵酮在大鼠體內的藥動學與組織分布[J].中國藥理學與毒理學雜志,2010,24(1): 59-63.

［5］何萍,顧炳,王晨瑜,等.去鐵酮緩釋片在犬體內的藥動學及生物等效性[J].中國臨床藥學雜志,2008,17(4): 220-223.

［6］鞏泉泉,劉萍,徐華雷,等.去鐵酮大鼠血漿蛋白結合率的實驗研究[J].山東大學學報:醫學版,2009,47(12): 130-132.

［7］LIE MG L,TOTSAPOL J,PIYADA J,et al.Pharmacokinetics of deferiprone in patients withβ-thalassaemia[J]. Clin Phamracokinet,2011,50(1):41-50.

［8］LIE MG L,TOTSAPOL J,JEERANUT T,et al.UGT1A6 genotype-related pharmacokinetics of deferiprone(L1)in healthy volunteers[J].Br JClin Pharmacol,2008,65(6): 908-916.

［9］ABBASM,NAWAZ R,IQBAL T,et al.Quantitative determination of deferiprone in human plasma by reverse phase high performance liquid chromatography and its application to pharmacokinetic study[J].Pak J PharmSci,2012,25 (2):343-348.

DOI 10.3870/yydb.2014.02.008

High Performance Liquid Chromatography Method for Determination of Deferiprone in Human Plasma

LU Hua1,CHENG Dao-hai1,LEI Xiao-guang1,HE Yun-yan2,WAN Rui-rong1,SU Ming1,WU Ke-jie3, LUO Jian-ming2
(1.Department of Pharmacy;2.Department of Paediatrics,the First Hospital of Guangχi Medical University,Nanning 530021,China;3.Grade of 2009,Department of Pharmacy,Guilin Medical College,Guilin 541004,China)

Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for the determination of deferiprone in human plasma.MethodsThe analytical column was a Kromasil C18column(4.6 mm×200 mm,5μm).The mobile phase was amixture of acetonitrile and buffer of50 mmol·L-1potassiumdihydrogen phosphate(containing 5 mmol·L-1sodiumheptanesulfonate and 1%triethylamine)(11∶89,pH adjusted to 1.3 with phosphoric acid).Detection wave-length was set at 278 nm.The column temperature was25℃.The injected volume was20μL.Flow rate was1 mL·min-1.ResultsThe calibration curve of deferiprone were linear in the range of0.5-80.0mg·L-1(r＝0.996 5),and the lower limit of detection was 0.5 mg·L-1.The absolute recoveries of deferiprone at low,mediumand high concentrations weremore than 85.6%,and the method recoveries were more than 89.9%.The intraday coefficients of variation were 1.61%-3.70%,and the interday coefficients of variation were 1.84%-4.81%.ConclusionThemethod is simple,quick,accurate,sensitive,and specific, and can be used in detecting deferiprone concentration in human p lasma.

Deferiprone;Human plasma;High performance liquid chromatography;Content determination

R969.1

A

1004-0781(2014)02-0164-04

2013-03-21

2013-06-30

*廣西科技廳自然科學基金面上項目(2012GXNSFAA053145)；廣西衛生廳自籌經費科研課題(Z2011347)

陸華(1970-),男,廣西南寧人,副主任藥師,學士,研究臨床合理用藥。電話:0771-5356379,E-mail：hualude@sina.com。

羅建明(1958-),男,廣西貴港人,主任醫師,教授,博士,兒童血液病專業。電話:(0)13517667021,E-mail：luojm06@yahoo.com.cn。