參杞強(qiáng)精膠囊對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響*

田元春，張泉，雷崇忠，陸桂麗

(1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530023；2．桂林三金藥業(yè)股份有限公司，桂林 541004)

參杞強(qiáng)精膠囊對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響*

田元春1，張泉2，雷崇忠2，陸桂麗1

(1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530023；2．桂林三金藥業(yè)股份有限公司，桂林 541004)

目的觀察參杞強(qiáng)精膠囊對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能的影響。方法60只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組,正常組,模型組,參杞強(qiáng)精膠囊高、中、低劑量組(給予參杞強(qiáng)精1.0,0.5,0.25 g·kg-1)和陽性對(duì)照組(給予左旋咪唑0.05 g·kg-1),除空白組外,其他組皮下注射環(huán)磷酰胺(50mg·kg-1)建立免疫抑制小鼠模型。各組連續(xù)給藥10 d后,檢測(cè)小鼠外周白細(xì)胞數(shù)、免疫器官臟器指數(shù)、碳粒廓清能力、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清溶血素含量。結(jié)果參杞強(qiáng)精膠囊各劑量組小鼠的外周白細(xì)胞數(shù)量、碳粒廓清能力、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清溶血素含量均明顯提高(P<0.05或P<0.01),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高劑量參杞強(qiáng)精膠囊明顯提高胸腺和脾臟指數(shù)(P<0.05)。結(jié)論參杞強(qiáng)精膠囊對(duì)免疫抑制小鼠的免疫功能有正調(diào)節(jié)作用。

參杞強(qiáng)精膠囊；免疫功能；環(huán)磷酰胺

參杞強(qiáng)精膠囊由菟絲子、黨參、枸杞、五味子、黃芪、續(xù)斷、當(dāng)歸等中藥組成,具補(bǔ)腎健脾、活血養(yǎng)血、生精強(qiáng)精之功,臨床治療男性少、弱精子癥。《素問·六節(jié)藏象論》云“腎者,主蟄,封藏之本,精之處也”,《素問·金匱真言論》曰:“夫精者,身之本也,故藏于精者,春不病溫”,《脾胃認(rèn)·脾胃盛衰論》謂“百病皆由脾胃衰而生也”,《金匱要略》謂“四季脾旺不受邪”,說明腎和脾與免疫功能密切相關(guān)。該方補(bǔ)腎健脾,在免疫調(diào)節(jié)方面應(yīng)具有積極的作用。影響男性生殖的因素很多,遺傳、病原微生物感染、環(huán)境污染、肥胖、心理、輻射、化學(xué)治療等單個(gè)或者多個(gè)因素共同作用均可使精液質(zhì)量下降造成不育［1-3］,提升機(jī)體免疫功能有益于男性少、弱精的治療。前期研究表明,參杞強(qiáng)精膠囊能明顯提高弱精子癥模型動(dòng)物的精子質(zhì)量、提高大鼠附睪中超氧化物歧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷［4］。環(huán)磷酰胺為目前廣泛應(yīng)用的烷化劑,其副作用主要表現(xiàn)為免疫抑制。本實(shí)驗(yàn)探討參杞強(qiáng)精膠囊對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影響,為其進(jìn)一步應(yīng)用與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 參杞強(qiáng)精膠囊,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供,批號(hào):20111028；鹽酸左旋咪唑片,廣東南國藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào):110103。羧甲基纖維素鈉,廣東江門赫克力士化工有限公司生產(chǎn),批號(hào):091024。環(huán)磷酰胺,通化茂祥制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):110604。植物血凝素,Sigma公司。印度墨汁,北京西中化工廠。豚鼠血清:無菌采豚鼠血,分離血清置-20℃?zhèn)溆谩ｋu血紅細(xì)胞(chicken red blood cell,CRBC)混懸液制備:于無菌操作下,自雞翼下靜脈采血,置100 mL錐形瓶中,加入相當(dāng)于雞血體積5倍的Alserver′s溶液,混勻,4℃冰箱貯存。臨用時(shí)用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次,每次離心速度為3 000 r·min-1,離心10 min至CRBC壓積值恒定,棄去上清液和界面,直至按此值用0.9%氯化鈉溶液配成5%CRBC。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠,體質(zhì)量18～22 g,雌雄各半,廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(桂)2003-0003,試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證: SYKG(桂)2003-0005。小鼠分籠飼養(yǎng),飼料為標(biāo)準(zhǔn)固定鼠料,自由進(jìn)食、飲水,自然晝夜節(jié)律光照。飼養(yǎng)條件:飼養(yǎng)室面積30 m2,工作照度:150～300 lx,動(dòng)物照度:150～200 lx,氨濃度≤14 mg·(m3)-1,室溫(22± 1)℃,相對(duì)濕度(50±10)%,通過導(dǎo)流風(fēng)機(jī)與外界對(duì)流通風(fēng)換氣。

1.3 儀器 EL204型電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］,恒溫水浴箱(江蘇恒豐儀器制造有限公司),756紫外可見分光光度計(jì)(上海普華科技儀器有限公司),BIOFUGE28RS型低溫高速離心機(jī)(德國HERAEUS生產(chǎn)),LH50A顯微鏡(Olympus),YXQSG41-280型高壓蒸汽消毒器(上海醫(yī)用儀器制造)。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 小鼠60只,隨機(jī)分為6組,即正常組,模型組,參杞強(qiáng)精膠囊高、中、低3個(gè)劑量組和陽性對(duì)照組。采用灌胃方式給藥,藥物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成混懸液,現(xiàn)配現(xiàn)用。正常組及模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉(溶劑)10 mL·kg-1,參杞強(qiáng)精膠囊高、中、低劑量組按1.0,0.5, 0.25 g·kg-1給藥,陽性對(duì)照組給予左旋咪唑0.05 g·kg-1,每日給藥1次,連續(xù)10 d,每次0.4 mL。除正常組外,各組在第1,2,3天皮下注射環(huán)磷酰胺50 mg·kg-1造成免疫功能低下模型。

1.5 對(duì)外周血白細(xì)胞總數(shù)及胸腺、脾臟指數(shù)的影響 各組小鼠給藥10 d后,尾部取血,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)白細(xì)胞(white blood cell,WBC)。于末次給藥后1 h(禁食不禁水8 h),稱取小鼠體質(zhì)量,同時(shí)各組小鼠脫頸椎處死,取脾臟、胸腺,用濾紙吸干臟器表面血污,稱質(zhì)量并計(jì)算脾和胸腺指數(shù)。脾(或胸腺)指數(shù)＝脾(或胸腺)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)［5-6］。

1.6 對(duì)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 采用碳粒廓清法。于末次給藥30 min后,經(jīng)小鼠尾靜脈注入3倍稀釋的印度墨汁0.05mL·(10 g)-1。分別于1min和5min從眶后取血20μL,并將其加入到0.1%碳酸鈉溶液2 mL中搖勻,在分光光度計(jì)680 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值。根據(jù)公式計(jì)算廓清指數(shù)(K),K值經(jīng)體質(zhì)量及肝、脾質(zhì)量換算后,得吞噬指數(shù)α。K＝(lgA1-lgA2)/(t2-t1),A1表示1 min的A值,A2表示5 min的A值。吞噬指數(shù)(α)＝體質(zhì)量/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)×K1/3［6-7］。

1.7 對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響 各組小鼠于給藥前的第1～3天,肌內(nèi)注射植物凝集素10 mg·kg-1,于末次給藥后2 h,小鼠斷尾取血至玻片一端,另取一載玻片推片,自然干燥后,Giemsa-Wright染液染色,再用0.9%氯化鈉溶液沖洗,用濾紙將標(biāo)本吸水干燥后,鏡檢。每片計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞,記錄轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù),按公式計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(%)＝轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞/(轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞+未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞)×100%［6］。

1.8 對(duì)血清溶血素水平的影響 各組小鼠于給藥第4天,腹腔注射5%CRBC 0.3 mL免疫,末次給藥后24 h,每鼠從眼眶后靜脈叢取血約0.5 mL, 3 000 r·min-1離心,取血清20μL加入盛有0.9%氯化鈉溶液1.0 mL試管內(nèi),加入5%CRBC 0.5 mL,再加1∶10豚鼠血清稀釋液0.5 mL,混勻置37℃水浴中保溫30 min,取出,冰水浴10 min終止反應(yīng),轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1離心10 min,取上清液1.0 mL,加都氏液3.0 mL混勻,靜置10 min,在波長(zhǎng)546 nm處比色,用A值表示血清溶血素含量［6-7］。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 12.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)白細(xì)胞總數(shù)及胸腺、脾臟指數(shù)的影響 結(jié)果見表1。由表1可見,模型組WBC水平、胸腺和脾臟指數(shù)降低,與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),提示造模成功。參杞強(qiáng)精膠囊各劑量組WBC水平均提高,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；參杞強(qiáng)精膠囊給藥后,胸腺和脾臟指數(shù)比模型組有改善,中、高劑量胸腺指數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),高劑量組的脾臟指數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 6組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)及胸腺、脾臟指數(shù)的測(cè)定值Tab.1 Determination results of total peripheralwhite blood cells and indexes of thymus and spleen in six groups ofmine ±s

表1 6組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)及胸腺、脾臟指數(shù)的測(cè)定值Tab.1 Determination results of total peripheralwhite blood cells and indexes of thymus and spleen in six groups ofmine ±s

與模型組比較,*1P<0.05,*2P<0.01;與正常組比較,*3P<0.01,*4P<0.05Compared with model group,*1P<0.05,*2P<0.01;compared with normal group,*3P<0.01,*4P<0.05

組別小鼠/只劑量/ (g·kg-1) WBC/ (×109·L-1)胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)(mg·g-1)參杞強(qiáng)精膠囊低劑量組10 0.25 5.6±0.8*11.90±0.43 4.29±0.98中劑量組10 0.5 6.3±1.3*22.11±0.45*14.66±1.35高劑量組10 1.0 7.1±1.2*22.25±0.58*15.09±1.16*1陽性對(duì)照組10 0.05 7.3±1.3*22.38±0.52*25.16±1.42*1模型組10…4.4±0.9*31.58±0.37*33.46±1.22*4正常組10…7.9±1.1 2.69±0.51 5.39±1.37

2.2 對(duì)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 結(jié)果見表2。由表2可見,模型組廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α降低,與正常組比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。參杞強(qiáng)精膠囊各劑量廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α提高,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表2 6組小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of phagocytosis by mononuclear macrophage in six groups of mice ±s

表2 6組小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of phagocytosis by mononuclear macrophage in six groups of mice ±s

與模型組比較,*1P<0.05,*2P<0.01;與正常組比較,*3P< 0.01Compared with model group,*1P<0.05,*2P<0.01;compared with normal group,*3P<0.01

組別小鼠/只劑量/ (g·kg-1)廓清指數(shù)(K)吞噬指數(shù)(α)參杞強(qiáng)精膠囊低劑量組10 0.25 0.029±0.007*14.512±0.082*2中劑量組10 0.5 0.031±0.009*14.683±0.134*2高劑量組10 1.0 0.032±0.011*14.727±0.092*2陽性對(duì)照組10 0.05 0.041±0.006*24.933±0.067*2模型組10…0.021±0.009*34.299±0.101*3正常組10…0.072±0.008 7.384±0.085

2.3 對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響 結(jié)果見表3,模型組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率下降,與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。參杞強(qiáng)精膠囊各劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率提高,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),中、高劑量組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率恢復(fù)到正常組水平。

2.4 對(duì)血清溶血素水平的影響 結(jié)果見表3。由表3可見,模型組血清溶血素下降,與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。參杞強(qiáng)精膠囊各劑量組的血清溶血素提高,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,參杞強(qiáng)精膠囊對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠有顯著的防御白細(xì)胞下降作用,提升胸腺、脾腺指數(shù),提示對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫器官的萎縮有較好的防御作用；明顯提高廓清指數(shù)和吞噬指數(shù),對(duì)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能具有明顯的激活、增強(qiáng)作用,提示參杞強(qiáng)精膠囊對(duì)小鼠非特異性免疫功能具有增強(qiáng)作用；還可明顯改善環(huán)磷酰胺所致的小鼠血清溶血素含量降低現(xiàn)象,促進(jìn)小鼠溶血素抗體生成,提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,呈一定量效關(guān)系,提示參杞強(qiáng)精膠囊可提高小鼠特異性體液免疫和細(xì)胞免疫功能。

據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道,結(jié)合廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科多年的臨床經(jīng)驗(yàn),課題組認(rèn)為腎虛、肝郁、脾虛、血瘀是少、弱精子癥的基本病機(jī),治療上以健脾益腎法為主,健脾益腎、先后天同治,補(bǔ)腎疏肝、精血同治,通絡(luò)活血、祛濕化瘀,以此理論為指導(dǎo)研制了參杞強(qiáng)精膠囊治療少、弱精子癥。筆者在本研究中初步觀察參杞強(qiáng)精膠囊對(duì)免疫低下小鼠的影響,結(jié)果表明其對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠有免疫增強(qiáng)功能,能改善非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫,同時(shí)增強(qiáng)免疫防御功能,其作用機(jī)制還有待深入研究。

表3 6組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清溶血素水平的測(cè)定值Tab.3 Determination results of lymphocyte transformation rate and serumhemolysin content in six groups of mice ±s

表3 6組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清溶血素水平的測(cè)定值Tab.3 Determination results of lymphocyte transformation rate and serumhemolysin content in six groups of mice ±s

與模型組比較,*1P<0.01;與正常組比較,*2P<0.01Compared with model group,*1P<0.05;compared with normal group,*2P<0.01

組別小鼠/只劑量/ (g·kg-1)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率/%A值參杞強(qiáng)精膠囊低劑量組10 0.25 39.44±6.15*10.093±0.012*1中劑量組10 0.5 40.58±3.46*10.125±0.014*1高劑量組10 1.0 41.93±4.81*10.140±0.017*1陽性對(duì)照組10 0.05 44.85±5.67*10.151±0.016*1模型組10…22.59±2.73*20.044±0.009*2正常組10…40.27±3.58 0.186±0.011

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.011

Influences of Shenqi qiangjing Capsule on the Immune Function of Immunosuppressed Mice

TIAN Yuan-chun1,ZHANG Quan2,LEI Chong-zhong2,LU Gui-li1
(1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Guangχi University of Chinese Medicine,Nanning 530023,China;2.Guilin Sanjin Pharmaceutical Co.Ltd.,Guilin 541001,China)

Objective To observe the immuno-regulatory effect ofshenqi qiangjingcapsule(SQQJC)on mice treated with cyclophosphamide.MethodsSixty mice were randomly divided into the control group,model group,positive group,SQQJC-high,mediumand low dose groups.Except in the control group,all mice were injected with cyclophosophamide(50 mg·kg-1).Mice in the SQQJC-high,mediumand low dose groups were administered with 1.0,0.5,and 0.25 mg·kg-1SQQJC,respectively.Mice in the control group were administered with solvent.Mice in the positive group were administered with levamisole for 10 days.Themice were examined for the total peripheralwhite blood cells,immune organ weight index,carbon particle clearance capability ofmacrophage,the lymphocyte transformation rate and the serumhemolysin content.ResultsCompared with the model group,the peripheral white blood cells,carbon particle clearance capability of macrophage,the lymphocyte transformation rate and the serumhemolysin contentwere significantly increased inmice treated with SQQJC at low,mediumand high doses(P<0.05 orP<0.01);the immune organ weight indexes were significantly increased in mice treated with SQQJC at high dose(P<0.05).ConclusionSQQJC can improve the immune function of the immunosuppressed mice.

Shenqi qiangjingcapsule;Immune function;Cyclophosphamide

R285.5

A

1004-0781(2014)02-0176-04

2013-03-20

2013-08-01

*廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥醫(yī)院制劑類課題(GZYZ-10-05)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)課題(GZYZ1101)

田元春(1971-),女,廣西南寧人,副主任藥師,學(xué)士,研究方向:臨床藥學(xué)和醫(yī)院藥學(xué)。電話:0771-5840015, E-mail：tianyc1989@163.com。