鎮肝熄風湯預處理對大腦中動脈梗死大鼠腦組織ET-1和AQP4及AQP9表達的影響*

吳艷霞，李秀娟，馬威

(武漢市第一醫院 1．老年病科；2．中心實驗室，武漢 430022)

鎮肝熄風湯預處理對大腦中動脈梗死大鼠腦組織ET-1和AQP4及AQP9表達的影響*

吳艷霞1，李秀娟1，馬威2

(武漢市第一醫院 1．老年病科；2．中心實驗室，武漢 430022)

目的通過檢測大腦中動脈梗死(MCAO)大鼠腦組織的內皮素(ET)-1、水通道蛋白4(AQP4)及水通道蛋白9(AQP9)含量的變化來研究鎮肝熄風湯發揮神經保護作用的可能生物學基礎。方法MCAO術前給予大、小劑量鎮肝熄風湯(3.0,1.5 g·mL-1)灌胃14 d,采用線栓法制備MCAO。評價鎮肝熄風湯預處理對MCAO大鼠腦缺血后行為障礙及腦水腫程度的影響;應用免疫組化方法研究鎮肝熄風湯預處理對MCAO大鼠腦組織ET-1的影響;采用western blot技術分析MCAO大鼠缺血側腦組織AQP4與AQP9表達量的變化和鎮肝熄風湯預處理對其的影響。結果預先使用鎮肝熄風湯14 d,可明顯改善MCAO大鼠行為學障礙,減輕腦水腫程度;MCAO大鼠缺血側腦組織中ET-1蛋白表達量均有不同程度下降;明顯增加MCAO大鼠缺血側腦組織AQP4與AQP9蛋白表達量。結論鎮肝熄風湯預處理可抑制ET-1表達,增加AQP4與AQP9表達,減輕腦水腫程度。

鎮肝熄風湯；梗死,中動脈,大腦；內皮素-1；水通道蛋白

傳統中藥在過去的幾千年中積累豐富的治療腦卒中的臨床經驗［1］。鎮肝熄風湯是治療中風的常用方劑,臨床上也常用于高血壓病屬肝腎陰虧、肝陽上亢者,在治療原發性高血壓及缺血性腦卒中方面有著確切的療效。筆者對鎮肝熄風湯的前期研究結果顯示,該方具有減輕原發性高血壓大鼠腦皮質神經元損傷的作用［2］。既往研究顯示鎮肝熄風湯預先使用具有良好的對抗缺血引起的神經細胞凋亡的作用［3］。由此,筆者推測應用鎮肝熄風湯對缺血性腦卒中個體進行早期干預,可能會有著較好的治療效果。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一種細胞快速調節自身體積和內部滲透壓的水分子通道,其在腦水腫病理生理學機制中起到重要的作用。在腦內已發現的AQPs中,AQP4與AQP9是腦內表達量最多、與缺血性腦損傷發生后腦組織含水量增加密切相關的水通道蛋白［4-5］。內皮素(endothelin,ET)是一類生物活性多肽,主要分布于心血管、腦、肝等組織器官的內皮細胞中,具有強大的縮血管作用［6］。研究表明ET-1過量表達是導致缺血性腦損傷后AQP4與AQP9表達、腦組織含水量增加的重要因素［7］,故本實驗在前期研究的基礎上,進一步觀察鎮肝熄風湯預處理干預大腦中動脈梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠后,對腦組織ET-1表達的影響,同時觀察MCAO大鼠缺血側腦組織AQP4與AQP9表達量的變化和不同劑量鎮肝熄風湯對其的影響,以探討鎮肝熄風湯減輕局部腦水腫、改善神經功能的生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級Wistar大鼠96只,體質量260～300 g,動物生產許可證號:SCXK(鄂)2011-0002,雌雄不限,由華中科技大學實驗動物中心提供。ET-1免疫組織化學檢測試劑盒(SABC,武漢博士德生物工程有限公司),兔抗大鼠AQP4多克隆抗體(Chemico, US),兔抗大鼠AQP9多克隆抗體(Chemico,US),兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(Santa Cruz,US),蛋白雜交膜(Schleicher and Schuell)。

1.2 方法

1.2.1 鎮肝熄風湯制備 處方:懷牛膝、代赭石各30 g,生龍骨、生牡礪、生龜甲、生杭芍、玄參、天冬各15 g,川楝子、生麥芽、茵陳各6 g,甘草4.5 g。藥物由湖北中醫藥大學中藥系提供,代赭石、生龍骨、生牡礪、生龜板先煎2 h,然后和其余藥物用8倍純化水常規煎煮3次,過濾,濃縮至生藥1.5和3.0 g·mL-1,4℃儲存備用。

1.2.2 動物分組與模型建立 模型制作參照Pantoni的線栓法制備大腦MCAO大鼠模型［8］。線栓法制備大腦中動脈梗塞的栓塞時間為1 h。假手術組除僅分離頸內外動脈,不閉塞大腦中動脈,其余手術步驟同模型組。將實驗大鼠隨機分為假手術組,模型組,低劑量鎮肝熄風湯組,高劑量鎮肝熄風湯組,每組24只。其中低、高劑量鎮肝熄風湯組大鼠于MCAO術前14 d灌胃給予相當于生藥1.5,3.0 g.mL-1鎮肝熄風湯,假手術組和模型組大鼠灌胃給予純化水,每100 g體質量給予1 mL,bid,共14 d。

1.2.3 行為學觀察 實驗動物在術后6 h被隨機分為4組,每組8只,參照SLAVIANKA等［9］方法進行行為學檢測。評分標準:①提鼠尾觀察前肢屈曲情況,如雙側前肢對稱伸向地面,計為0分；如手術的對側前肢出現腕屈、肘屈曲、肩內旋或既有腕肘屈曲又有肩內旋者,分別計為1,2,3,4分。②將動物置于平地面上,分別推雙肩向對側移動,檢查阻力,如雙側阻力對等且有力,計為0分；如向手術的對側推動時阻力下降者,根據下降程度的不同分為輕、中、重三度,分別計為1,2, 3分。③將動物雙前肢置于一金屬網上觀察雙前肢的肌張力,雙前肢肌張力對等且有力者計為0分；同樣根據手術對側肌張力下降程度不同計為1,2,3分；④動物有不停向一側轉圈者,計為1分。根據標準評分,滿分為11分,分數越高,動物行為障礙越嚴重。

1.2.4 稱質量法檢測腦組織含水量 各組取8只大鼠斷頭取腦,左右分開,分別稱定左右腦濕質量。105℃烘烤48 h至恒重,精確稱定干質量,計算含水量［9］。含水量(%)＝(濕重-干重/濕重)×100%。

1.2.5 免疫組織化學法檢測ET-1分布及表達 收集各組8只大鼠缺血腦組織,切除部分端腦組織,置4%多聚甲醛固定、脫水、包埋后進行切片,采用鏈霉親和素-生物素復合物(streptavidin-biotincomplex,SABC)法,以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)代替一抗作陰性對照。ET-1蛋白檢測一抗(兔抗大鼠ET-1),二抗(生物素標記山羊抗兔lgG)。染色步驟按照免疫組化試劑盒說明進行。結果判定:陽性反應為深棕色顆粒,計算ET-1陽性細胞數。陰性對照,染色時不加入一抗,結果為陰性。

1.2.6 Western blot檢測AQP4與AQP9蛋白表達量 取缺血側腦組織100 mg,用預冷的PBS緩沖液洗滌2次后加入適量細胞裂解液勻漿,吹勻于4℃放置30 min,12 000 r·min-1離心20min,留取上清液,取少量上清液采用考馬斯亮藍法檢測濃度,將所有蛋白樣品調至等濃度,-70℃保存。12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質,轉膜后以電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)發光試劑盒檢測AQP4和AQP9蛋白的表達。兔抗大鼠AQP4多克隆抗體、兔抗大鼠AQP9多克隆抗體(1∶400),兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(1∶750)作為內參。4℃搖勻過夜,加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的羊抗兔-IgG二抗(1∶1 000),室溫輕搖1 h。HRP-ECL發光法顯色。結果用凝膠成像分析系統測定蛋白條帶相對吸光度值(即目的片段吸光度值/內參照吸光度值),使用BandScan5.0版軟件測定,每組實驗均重復3次以上。

2 結果

2.1 大鼠行為學檢測 行為學檢測結果顯示,與假手術組比較,模型組和低、高劑量鎮肝熄風湯組大鼠行為學積分均顯著增加(P<0.01)；但與模型組比較,不同劑量鎮肝熄風湯均可有效改善大鼠行為學積分(P< 0.05)。見表1。

2.2 腦組織含水量檢測 腦組織含水量檢測結果顯示,模型組大鼠缺血側腦組織含水量較假手術組大鼠有非常顯著的增加(P<0.01)；不同劑量的鎮肝熄風湯預先使用均可明顯改善MCAO大鼠缺血側腦組織含水量(P<0.05)。見表1。

2.3 鎮肝熄風湯對缺血腦組織ET-1蛋白表達的影響 免疫組織化學檢測結果顯示,與假手術組比較,模型組大鼠缺血側腦組織中ET-1含量顯著升高(P< 0.01)；高、低劑量鎮肝熄風湯組MCAO大鼠缺血側腦組織中ET-1含量下降,且與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1,圖1。

2.4 缺血側腦組織AQP4與AQP9蛋白表達量檢測 Western blot檢測結果顯示,模型組大鼠缺血側腦組織AQP9蛋白表達量較假手術組大鼠有非常顯著的增加(P<0.01),但AQP4蛋白表達量較假手術組大鼠增加無顯著；低、高劑量鎮肝熄風湯預先使用可明顯增加MCAO大鼠缺血側腦組織AQP4與AQP9蛋白表達量(P<0.05),以高劑量鎮肝熄風湯作用更為顯著。鎮肝熄風湯對MCAO大鼠缺血側腦組織AQP4與AQP9蛋白表達量的影響見圖2。

表1 4組大鼠行為學積分、缺血側含水量、缺血對側含水量及ET-1蛋白表達的比較Tab.1 Comparison of behavioral integral,water content in ischemic cerebral tissues and contralateral cerebral tissues,as well as ET-1 protein expression among four groups of rats ±s

表1 4組大鼠行為學積分、缺血側含水量、缺血對側含水量及ET-1蛋白表達的比較Tab.1 Comparison of behavioral integral,water content in ischemic cerebral tissues and contralateral cerebral tissues,as well as ET-1 protein expression among four groups of rats ±s

與模型組比較,*1P<0.05,*2P<0.01Compared with model group,*1P<0.05,*2P<0.01

組別大鼠/只劑量/ (g·kg-1)行為學積分/分缺血側含水量/%缺血對側含水量/% ET-1陽性細胞百分數/%鎮肝熄風湯低劑量組8 15 6.22±1.42*182.05±0.64*177.05±0.59 24.32±6.76*2高劑量組8 30 5.93±2.10*280.27±0.75*176.87±0.48 17.44±5.24*2模型組8…8.44±2.01 89.62±0.77 77.62±0.63 56.24±8.18假手術組8…0.00±0.00*275.21±0.49*275.15±0.55 6.15±0.94*2

圖1 4組大鼠缺血側腦組織ET-1蛋白表達(SABC,×400)A.假手術組;B.模型組;C.低劑量鎮肝熄風湯組;D.高劑量鎮肝熄風湯組Fig.1 ET-1 protein expression in ischemic cerebral tissues in four groups of ratsA.shamoperation group;B.model group;C.low-dose zhenganχifeng decoction;D.high-dose zhengan ifeng decoction

圖2 鎮肝熄風湯對MCAO大鼠缺血側腦組織AQP4與AQP9蛋白的影響A.假手術組;B.模型組;C.低劑量鎮肝熄風湯組;D.高劑量鎮肝熄風湯組;與模型組比較,*1P<0.01,*2P<0.05

3 討論

腦組織含水量調節對維持中樞神經系統正常的生理功能至關重要。腦水腫是缺血性腦卒中發生、發展過程中的重要病理現象,是局部腦缺血性損傷、腦梗死面積擴大的重要原因。既往研究顯示,一側大腦中動脈閉塞后,病灶側大腦含水量可顯著增加,腦水腫程度是重要的早期腦損傷指標,并對腦損傷的發展有預測作用,而AQPs在腦水腫的發生發展的分子機制中發揮著重要的作用［10］。AQP4是腦內表達最多的AQP［11］,廣泛存在于腦組織,主要分布于星形膠質細胞、室管膜細胞、脈絡叢等部位［12-13］,參與腦脊液重吸收、滲透壓調節,并兼有細胞外滲透壓感受器和水平衡調節器的功能［14］,在腦組織水的運輸調節中起著重要作用。AQP9屬于水甘油通道,在腦組織中含量豐富,主要存在于室管膜細胞以及下丘腦內側基底部,分布于腦組織星型膠質細胞、血管內皮細胞和兒茶酚胺類神經元的胞膜上［15-18］,具有相對選擇通透性,與組織中水的轉運,水電解質的平衡調節有關,并參與調節中樞神經系統細胞外間隙與體循環之間的信號傳遞［19-22］。由于細胞水通道蛋白是組織細胞的水液代謝的重要調控者,故腦組織中主要水通道蛋白AQP4和AQP9的表達對異常的水液代謝有著重要的作用［23］。

本次實驗顯示,阻斷MCA 6 h后,所有動物均出現不同程度的運動障礙。與模型組比較,在MCAO前預先使用不同劑量鎮肝熄風湯均可有效改善大鼠行為學積分。MCAO大鼠腦組織含水量缺血側腦組織含水量較假手術組大鼠有非常顯著的增加,但不同劑量的鎮肝熄風湯預先使用均可明顯減少MCAO大鼠缺血側腦組織含水量。結果提示預先使用鎮肝熄風湯對局灶性腦缺血引起的中樞神經系統損傷及相應的行為學變化具有一定的改善作用。與假手術組比較,MCAO模型組大鼠在腦缺血6 h后,缺血側腦組織中ET-1蛋白質表達有顯著性升高,并與腦水腫程度呈正比,這與BARONE等［24］研究結果一致,而鎮肝熄風湯高、低劑量干預組MCAO大鼠缺血側腦組織中ET-1表達量均有不同程度下降。

MCAO模型組大鼠缺血6 h后缺血側腦組織AQP4蛋白表達量與假手術組比較差異無統計學意義,而AQP9蛋白表達量有非常顯著的增加,這與LO等［7］研究結果一致,推測缺血急性期即出現局部組織水代謝障礙,但在腦組織中表達量最大的AQP4蛋白表達改變不顯著。因此,AQP9蛋白應激性表達增加并不足以調節局部水液代謝障礙,以致腦水腫程度不斷加重。而鎮肝熄風湯預先使用可明顯增加MCAO大鼠缺血側腦組織AQP4與AQP9蛋白表達量。

綜上所述,鎮肝熄風湯可能通過下調急性局部腦缺血性損傷后產生ET-1的作用影響缺血后腦組織AQP4與AQP9表達,發揮其減輕腦水腫、改善神經功能的作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.012

Effect of Zhengan Xifeng Decoction Pretreatment on Endothelin-1 and Aquaporin Expression in Cerebral Tissue of Middle Cerebral Artery Occlusion Rats

WU Yan-xia1,LI Xiu-juan1,MA Wei2
(1.Department of Geriatrics;2.Center of Eχperimental Medicine, Wuhan First Hospital,Wuhan 430022,China)

Objective To study the neuroprotective effect ofzhenganχifengdecoction(ZGXFD),a tranditional Chinese herbal compound,on conscious ratswithmidd le cerebral artery occlusion(MCAO).MethodsThe ratmodel of focalcerebral ischemia was established with the suture-occuluded method and was treated with different doses of ZGXFD(1.5 and 3 g·mL-1,respectively)before MCAO.The effect of ZGXFD on the behavior disorder and extent of cerebral edema of the MCAO rats were detected.ET-1 expression in the rat brain tissues was examined by immunohistochemistry method.The AQP 4 and AQP 9 expression were determined by Western blotting.ResultsA fter MCAO,different degrees of behavior disorder appeared in all rats.Pretreatmentwith ZGXFD improved the grade of behavior disorder of the rats,reduced the extent of cerebral edema,and increased AQP4 and AQP9 obviously.After MCAO,the tissue ET-1 expression was increased obviously but the ZGXFD could reverse it.Compared with the MCAO group,the AQP9 protein expression significantly increased after 6 h of hypoxiawhile the AQP4 did not change.ConclusionThese findings suggest that ZGXFD can directlymodulate ET-1,AQP4 and AQP9 expression and reduce cerebral edema.

Zhenganχifengdecoction;Occlusion,middle artery,cerebral;Endothelin-1;Aquaporin

R285

A

1004-0781(2014)02-0179-05

2013-05-15

2013-08-19

*湖北省科技廳科技攻關計劃(2007AA301B09-3)

吳艷霞(1972-),女,湖北武漢人,副主任醫師,博士,主要從事老年心腦血管疾病方面的研究。電話:(0) 13871557955,E-mail：spring_w@126.com。