荔枝核總黃酮對肝纖維化大鼠肝組織TLR4/NF-κB信號通路的影響*

何志國，趙永忠，盧青，周英瓊，肖緒華，侯巧燕，黃大健，成秋宸

(桂林醫學院附屬醫院 1.消化內科;2.病理科，桂林 541004)

荔枝核總黃酮對肝纖維化大鼠肝組織TLR4/NF-κB信號通路的影響*

何志國1，趙永忠1，盧青1，周英瓊2，肖緒華1，侯巧燕2，黃大健1，成秋宸1

(桂林醫學院附屬醫院 1.消化內科;2.病理科，桂林 541004)

目的 探討荔枝核總黃酮(TFL)對膽管阻塞型肝纖維化大鼠肝組織Toll樣受體4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)表達的影響。方法雄性SPF級SD大鼠80只,隨機分為正常對照組、模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組。除正常對照組外,其余各組均采用膽總管結扎法(CBDL)制備肝纖維化大鼠模型。造模后第2天開始,正常對照組、模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃(5 mL·kg-1),TFL小劑量組給予TFL 100 mg·kg-1、TFL大劑量組給予TFL 200 mg·kg-1灌胃,均每天1次,共4周,第4周末處死大鼠,留取肝臟組織。蘇木精-伊紅(HE)染色、Masson染色觀察大鼠肝組織病理學改變,免疫組化法(IHC)檢測TLR4、NF-κB在4組大鼠肝組織內的表達。結果與模型組比較,TFL大劑量組肝組織纖維化程度明顯減輕,膠原表達明顯減少(P＜0.01);正常對照組、模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組的大鼠肝組織TLR4免疫組化評分分別為(0.4±0.5),(3.3±0.6),(3.1±0.5),(1.4±0.5)分;NF-κB免疫組化評分分別為(0.80± 0.77),(5.12±0.89),(4.68±0.70),(3.47±0.61)分,模型組TLR4、NF-κB表達明顯高于正常對照組和TFL大劑量組(P＜0.01),與TFL小劑量組比較,差異無統計學意義。結論TLR4和NF-κB高表達可能與膽管阻塞型大鼠肝纖維化的發生發展有關,大劑量荔枝核總黃酮可能通過抑制大鼠肝組織TLR4、NK-κB的表達來改善膽管阻塞型大鼠肝纖維化程度。

荔枝核總黃酮；肝纖維化；Toll樣受體4；核因子-κB

肝纖維化是指以膠原為主的細胞外基質在肝臟內過度沉積,是多種慢性肝病共有的、漸進性的病理階段,其中細胞因子的表達異常在肝纖維化發生發展中起著關鍵作用。Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)作為細胞膜上的跨膜信號傳遞分子,可通過信號轉導參與配體介導的肝臟內多種細胞的激活及多種細胞因子的分泌,在肝纖維化的發生及發展機制中具有重要的作用[1]。核因子κB(nuclear factor-kappa-B,NF-κB)位于TLR下游信號通路的樞紐位置,細胞受到生物刺激后激活NF-κB,活化的NF-κB進入細胞核調節炎性細胞因子的表達,參與炎癥反應及肝纖維化過程[2]。荔枝核提取物具有行氣散結、驅寒止痛之功效。近年的研究表明,荔枝核總黃酮(total flavone of Litchi Chinensis Sonn,TFL)是荔枝核中具有藥理活性的主要成分之一,具有抗病毒[3-4]、抗肝損傷[5]和抗氧化[6]等作用?，F有研究結果表明,姜黃素及TFL均具有抗膽管阻塞型大鼠肝纖維化作用[7-9]。迄今為止,有關肝纖維化過程中TLR4蛋白在肝組織內表達的情況鮮有報道。筆者在本研究中以膽總管結扎所致大鼠肝纖維化模型為研究對象,進一步探討TFL對膽管阻塞型大鼠肝組織中TLR4和NF-κB表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠80只,體質量(200± 20)g,由桂林醫學院實驗動物中心提供,動物許可證號: SCXK(桂)2007-0001。TLR4、NF-κB蛋白檢測所用Ⅰ抗為兔抗小鼠多克隆抗體,均購自Bioworld公司,Ⅱ抗為辣根過氧化物酶偶聯羊抗兔IgG,購自北京中山金橋生物技術有限公司。超敏發光試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。即用型SP試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。TFL由桂林工學院有機化學教研室加工提取,經檢測TFL含量為852 g·kg-1,將其粉末狀物用純化水稀釋成40 g·L-1溶液。

1.2 動物分組及處理 參照文獻[10]制備膽總管阻塞性肝纖維化大鼠模型,將80只SD大鼠隨機分成4組,即正常對照組、模型組、TFL小劑量組和TFL大劑量組,每組20只。模型組大鼠1%戊巴比妥鈉(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后正中開腹,游離膽總管,雙重結扎,兩結扎線中間剪斷后關腹。正常對照組大鼠游離膽總管而不結扎,關腹。其余組同模型組。術后第2天開始分組給藥。①正常對照組:0.9%氯化鈉溶液灌胃,5 mL·kg-1·d-1;②模型組:同正常對照組;③TFL小劑量組:TFL灌胃,100 mg·kg-1·d-1;④TFL大劑量組:TFL灌胃,200 mg·kg-1·d-1。均每天1次,共4周,第4周末全部處死,留取各組肝臟組織。

1.3 肝臟組織病理學檢查 取相同部位肝臟,用4%甲醛固定,石蠟包埋,切片,行蘇木精-伊紅(hematoxylineosinstaining,HE)染色,光鏡下觀察肝臟病理變化并參考文獻[11]進行分期。常規Masson染色,膠原纖維組織染成綠色,每張切片隨機選取高倍視野5個,Leica Qwin V3圖像分析系統(德國Leica公司)計算每個視野膠原纖維面積。

1.4 采用免疫組化法(IHC)檢測TLR4、NF-κB的表達 嚴格按照SP試劑盒操作說明進行。I抗稀釋濃度1∶100。參考文獻[12]對各蛋白在肝組織中的陽性表達進行半定量分析。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0版軟件進行數據處理,實驗數據以均數±標準差(±s)表示,分析前行正態性檢驗方差齊性檢驗,如符合條件,采用完全隨機設計資料的單因素方差分析,不符合條件,采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 本實驗共有9只大鼠死亡,均不進入統計數據。膽總管結扎后大鼠活動及攝食減少,精神萎靡,1～6 d后,耳朵、眼睛、雙爪出現黃染,尿液呈濃茶色,取模型組大鼠肝臟組織時,發現其肝臟呈深黃色,變形且增大,表面結節樣改變,邊緣圓鈍,膽管擴張膨出伴膽汁淤積,質硬。

2.2 各組大鼠肝組織病理學檢測結果 HE染色(圖1)見正常對照組大鼠肝臟組織肝小葉結構完整,肝細胞排列整齊,無炎癥壞死及纖維增生。模型組大鼠肝臟組織肝小葉結構及肝細胞索排列紊亂,大量肝細胞壞死,肝實質內及膽管周圍可見不同程度的膠原沉積,匯管區、匯管區之間、匯管區與中央靜脈之間小膽管彌漫性增生,部分可見假小葉形成,病理分期以Ⅲ、Ⅳ期為主;TFL小劑量組匯管區小膽管增生明顯,纖維間隔伴小葉結構紊亂,較TFL大劑量組明顯,但不及模型組,以Ⅲ、Ⅳ期為主;TFL大劑量組匯管區增生較模型組明顯縮小,偶見點、灶狀壞死,纖維組織增生減少,肝小葉結構趨于正常,中央靜脈周圍見少量膠原沉積,匯管區周圍纖維化,界限清楚,病理分期以Ⅰ、Ⅱ期為主, TFL大劑量組肝纖維化程度明顯低于模型組。Masson染色結果(圖2)提示模型組膠原纖維面積與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01),TFL大劑量組膠原纖維面積與模型組相比差異有統計學意義(P＜0.01),TFL小劑量組膠原纖維面積與模型組相比差異無統計學意義。各組肝纖維化程度分期及膠原纖維面積具體數值見表1,2。

表1 4組大鼠肝組織肝纖維化程度分期結果Tab.1 Stage results of liver fibrosis in 4 groups of rats 只

表2 4組大鼠Masson染色膠原纖維面積計算結果Tab.2 Collagen fiber area of liver tissue by Masson staining in 4 groups of rats ±s

表2 4組大鼠Masson染色膠原纖維面積計算結果Tab.2 Collagen fiber area of liver tissue by Masson staining in 4 groups of rats ±s

與模型組比較,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

組別大鼠/只膠原纖維面積/μm2TFL小劑量組161 092.7±105.2大劑量組19772.9±168.9*1模型組161 172.5±108.4正常對照組20377.4±19.8

2.3 IHC檢測肝組織TLR4、NF-κB的表達 TLR4主要表達于肝細胞、庫普弗細胞、內皮細胞以及膽管上皮細胞等多種細胞的細胞質和細胞膜。正常對照組肝組織內TLR4蛋白呈陰性或弱陽性表達,模型組肝組織中TLR4的蛋白的表達均明顯高于正常對照組,呈淡黃色、棕黃色或棕褐色染色,差異有統計學意義(P＜0.01)。TFL小劑量組肝組織內TLR4蛋白陽性表達低于模型組,差異無統計學意義(P＞0.05)。TFL大劑量組肝組織內TLR4蛋白表達較模型組明顯降低,大部分以淡黃色染色為主,偶見棕黃色及棕褐色染色,差異有統計學意義(P＜0.01)。NF-κB的表達:正常對照組及TFL大劑量組大鼠肝組織內僅呈弱陽性表達,而在模型組及TFL小劑量組肝組織細胞質或細胞核可觀察到明顯棕色顆粒,NF-κB呈強陽性。各組免疫組織評分及化學染色見表3和圖3,4。

圖1 4組大鼠肝組織HE染色(×200)A.正常對照組;B.模型組;C.TFL小劑量組;D.TFL大劑量組Fig.1 HE staining on liver tissue of 4 groups of rats(×200)A.normal control group,B.model group,C.low-dose TFL group,D.high-dose TFL group

圖2 4組大鼠肝組織Masson染色(×100)A.正常對照組;B.模型組;C.TFL小劑量組;D.TFL大劑量組Fig.2 Masson staining on liver tissue of 4 groups of rats(×100)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

表3 4組大鼠肝組織TLR4與NF-κB免疫組化評分結果Tab.3 Results of TLR4、NF-κB expressions in liver tissue by immunohistochemical staining 分,±s

表3 4組大鼠肝組織TLR4與NF-κB免疫組化評分結果Tab.3 Results of TLR4、NF-κB expressions in liver tissue by immunohistochemical staining 分,±s

與模型組比較,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

組別大鼠/只TLR4NF-κB TFL小劑量組163.1±0.54.68±0.70大劑量組191.4±0.5*13.47±0.61*1模型組163.3±0.65.12±0.89正常對照組200.4±0.50.80±0.77

3 討論

本研究采用膽總管結扎法復制類似人膽汁淤積性肝纖維化的大鼠模型,該模型具有操作簡便、重現性好、造模時間短等優點。本研究結果表明模型組全部大鼠肝臟組織肝小葉結構及肝細胞索排列紊亂,大量肝細胞壞死,肝實質內及膽管周圍可見不同程度的膠原沉積,匯管區、匯管區之間、匯管區與中央靜脈之間小膽管彌漫性增生,部分可見假小葉形成,提示模型復制成功。采用大劑量TFL干預后,大鼠肝纖維化程度減輕,匯管區增生明顯縮小,偶見點、灶狀壞死,纖維組織增生減少,肝小葉結構趨于正常,而TFL小劑量組在肝組織病理學變化、減少肝組織膠原沉積上與模型組比較均差異無統計學意義。說明大劑量TFL對膽汁淤積性肝纖維化大鼠有顯著的治療作用。本實驗免疫組化結果顯示,模型組大鼠TLR4、NF-κB的表達明顯升高,而TFL大劑量組表達較低,組間差異有統計學意義,說明TLR4的過度表達可能激活細胞內NF-κB通路,參與了肝纖維化的發生和發展,而大劑量TFL對其表達有一定抑制作用。其機制可能為膽總管結扎術后大鼠出現梗阻性黃疽,會導致腸道屏障功能下降,庫否細胞功能受損,細菌位移入血,細菌及其產物造成的毒血癥,導致腸源性內毒素血癥發生,誘導了肝組織內TLR4的高表達,引起下游傳導信號NF-κB的活化和核內轉移。大劑量TFL可下調肝組織內TLR4的表達,有效抑制NF-κB的激活,減少了免疫反應與炎癥反應的細胞因子表達所致的HSC的活化增殖,發揮抗肝纖維化作用[13-19]。

圖3 4組大鼠肝組織TLR4蛋白免疫組織化學染色(SP法×400)A.正常對照組;B.模型組;C.TFL小劑量組;D.TFL大劑量組Fig.3 Immunohistochemical staining on TLR4 protein in liver tissue of 4 groups of rats(SP×400)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

圖4 4組大鼠肝組織NF-κB免疫組織化學染色(SP法×400)A.正常對照組;B.模型組;C.TFL小劑量組;D.TFL大劑量組Fig.4 Immunohistochemical staining on NF-κB in liver tissue of 4 groups of rats(SP×400)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

綜上所述,隨著肝纖維化程度的加重,TLR4、NF-κB在大鼠肝纖維化組織細胞膜、細胞質、細胞核中表達均明顯增加,而大劑量TFL可能通過降低肝組織中TLR4、NF-κB的表達而發揮抗肝纖維化的作用。這為抗肝纖維化的新藥開發及TLR4/NF-κB信號通路的理論研究提供了新的方向。

[1] BEUTLER B.Inferences,questions and possibilities in Tolllike receptor signaling[J].Nature,2004,430(6996):257-263.

[2] 趙彩彥.核因子-κB與酒精性肝病[J].國外醫學:消化系統疾病,2002,22(4):230.

[3] 肖柳英,曾文鋌,馬佩球,等.荔枝核顆粒劑治療慢性乙型肝炎臨床療效研究[J].中華中醫藥雜志,2005,20 (7):444-445.

[4] 徐慶,宋蕓娟,李麗亞.荔枝核總黃酮的抗鴨乙型肝炎病毒作用[J].世界華人消化雜志,2005,13(17):2082-2085.

[5] 鄧志軍,郭潔文,潘竟鏘.荔枝和荔枝核及其有效部位的藥理及藥效學作用[J].今日藥學,2009,19(5):7-9.

[6] XIAO L Y,PAN J Q,JIAO W N,et al.The research of effect protection of model litchi seed on immuological hepatitis and acute live-injured in mice[J].China Practical Medical,2006,1(1):11-12.

[7] 趙永忠,漆志平,徐慶.荔枝核總黃酮抗膽管結扎大鼠肝纖維化的作用及機制[J].世界華人消化雜志,2010,18 (20):2084-2089.

[8] 趙永忠,肖緒華,漆志平.荔枝核總黃酮對大鼠肝纖維化TGF-β1及CTGF表達的影響[J].河北醫藥,2010,32 (10):1194-1196.

[9] 張小斌,曾令蘭,陳莎燕,等.姜黃素對肝纖維化模型大鼠肝纖維化組織細胞因子的影響[J].醫藥導報,2011, 30(4):443-446.

[10] RAETSCH C,JIA J D,BOIGK G,et al.Pentoxifylline down regulates profibrogenic cytokines and procollagen expression in rat secondary biliary fibrosis[J].Gut,2002,50(2):241-247.

[11] 中華肝臟病學會肝纖維化學組.肝纖維化診斷及療效評估共識[J].中華肝臟病雜志,2002,10(10):327-328.

[12] 許良中,楊文濤.免疫組織化學反應結果的判定標準[J].中國癌癥雜志,1996,4(6):229-231.

[13] BATALLER R,BRENNER D A.Liver fibrosis[J].Clin Invest,2005,115(2):209-218.

[14] FRIEDMAN S L.Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J]. Gastroenterology,2008,134(6):1655-1669.

[15] SATO M,SUZUKI S,SENOO H.Hepatic stellate cells:unique characteristics in cell biology and phenotype[J].Cell Struct Funct,2003,28(2):105-112.

[16] 金生.Toll樣受體與肝臟疾病[J].中華內科雜志,2005, 14(1):68-69.

[17] KATSARGYRIS A,KLONARIS C,ALEXANDROU A,et al.Toll-like receptors in liver ischemia reperfusion injury:a novel target for therapeutic modulation[J].Exp Opin Ther Targets,2009,13(4):427-442.

[18] 王坤寧,徐敏.TLR4,NF-κB與急性胰腺炎[J].世界華人消化雜志,2007,15(25):2684-2689.

[19] PAIK Y H,SCHWABE R F,BATALLER R,et al.Toll-like receptor 4 mediates inflammatory signaling by bacterial lipopolysaccharide in human hepatic stellate cells[J].Hepatology,2003,37(5):1043-1055.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.004

Effect of Total Flavone from Litchi chinensis Sonn on the Expression of TLR4 and NF-κB in Livers of Rats with Hepatic Fibrosis

HE Zhi-guo1,ZHAO Yong-zhong1,LU Qing1,ZHOU Ying-qiong2,XIAO Xu-hua1,HOU Qiao-yan2, HUANG Da-jian1,CHENG Qiu-chen1
(1.Department of Gastroenterology;2.Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin 541004,China)

Objective To investigate the effects of total flavone ofLitchi chinensisSonn(TFL)on TLR4 and NF-κB expression in the livers of rats with hepatic fibrosis.MethodsEighty male SD rats were randomly divided into four groups:normal control,model control,TFL at low-dose(100 mg·kg-1·d-1)and high-dose(200 mg·kg-1·d-1).The model of liver fibrosis in rats was induced by ligating common bile duct(CBDL)for all rats except for the normal controls.The rats were treated with TFL and 0.9%physiological saline in the tested,the normal and model groups,respectively once a day for 4 weeks.All rats were sacrificed in the end,and the livers were collected for histopathological studied by hematoxylin-eosin(H&E)staining and Masson Trichrome(MT)examination.The expressions of TLR4 and NF-κB in livers of above four groups were detected by immune-histologic chemistry(IHC).ResultsCompared with the model group,significantly milder liver fibrosis and lower collagen expression were found in the high-dose of TFL treated group(P＜0.01).The score of TLR4 expression in the normal and model groups,TFL at low-dose and high-dose was(0.4±0.5),(3.3±0.6),(3.1±0.5),(1.4±0.5),and that of NF-κB was (0.80±0.77),(5.12±0.89),(4.68±0.70),and(3.47±0.61),respectively.The protein expression of TLR4 and NF-κB in the model group was significantly higher than that in the normal control and TFL high-dose group(P＜0.01),but had no obvious difference from the lower dose group.ConclusionHigher expression of TLR4 and NF-κB may be involved in the liver fibrogenisis and development by CBDL in rats.TFL at high-dose may improve liver fibrosis induced by CBDL via inhibiting the expression of TLR4 and NF-κB in hepatic tissue in rats.

Total flavone ofLitchi chinensisSonn;Hepatic fibrosis;Toll-like receptor 4;NF-κB

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0286-05

2013-05-10

2013-06-20

*廣西壯族自治區自然科學基金項目(2012GXNSFAA053105);廣西壯族自治區教育廳科研資助項目(201012MS172);國家自然科學基金資助項目(81360659)

何志國(1978-),男,湖北隨州人,主治醫師,碩士,主要從事消化內科專業工作。E-mail：hezhiguo429001@21cn.com。

趙永忠(1968-),男,廣西桂林人,主任醫師,教授,碩士生導師,研究方向:慢性肝病的基礎與臨床。E-mail：zyz-1968@163.com。