小鉆提取物抗炎鎮痛活性研究*

莫單丹，唐炳蘭，周小雷，王碩，劉振杰，谷筱玉，袁經權

(廣西藥用植物研究所天然藥物化學組分研究室，南寧 530023)

小鉆提取物抗炎鎮痛活性研究*

莫單丹，唐炳蘭，周小雷，王碩，劉振杰，谷筱玉，袁經權

(廣西藥用植物研究所天然藥物化學組分研究室，南寧 530023)

目的 篩選小鉆抗炎鎮痛活性部位,為小鉆的開發利用提供實驗依據。方法萃取法制備不同極性小鉆提取物(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物)。將小鼠分為正常組、陽性對照阿司匹林組(50 mg·kg-1)或洛芬待因組(含可待因6.76 mg·kg-1)和小鉆石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物組(500 mg·kg-1),均灌胃給藥7 d。通過二甲苯致小鼠耳腫脹、小鼠棉球肉芽腫的體內實驗及各萃取物調節脂多糖(LPS)誘導小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞分泌一氧化氮(NO)水平的體外實驗篩選抗炎活性部位,通過小鼠熱板法、醋酸扭體法篩選鎮痛活性部位。結果小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均能顯著抑制二甲苯所致的小鼠急性耳廓腫和小鼠棉球肉芽腫(P＜0.05,P＜0.01),且均能顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放(P＜0.01),具備一定抗炎活性;小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均能顯著減少冰醋酸所致小鼠扭體次數,提高熱板致痛鼠的痛閾(P＜0.05,P＜0.01),具有一定的鎮痛作用。結論小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎鎮痛活性。

小鉆提取物；抗炎；鎮痛

小鉆(瑤語:fiuv nzunx)為瑤藥經典“老班藥”中“十八鉆”之一,別名小怎美(fiuv zing hmei)、銅精端、小鉆骨風、南五味子、紅木香、紫金皮、內風消、大活血,來源于五味子科南五味子屬植物長梗南五味子Kasdsura longipedunculataFinet et Gagnep的根和莖。主要分布于我國南部,如云南、四川、浙江、福建、廣東、廣西等省。小鉆味甘、苦、辛,性溫,屬風打相兼藥。能健脾補腎,理氣活血,祛風通絡,消腫止痛。小鉆為廣西瑤醫習用藥材,用于治療產后水腫、經閉腹痛、疝氣痛、腎虛腰痛、胃痛、頭風痛、風濕性關節炎、跌打損傷和骨折等[1]。目前未見關于小鉆抗炎鎮痛活性方面的報道。筆者在本實驗中對小鉆的抗炎鎮痛活性進行研究,以期為進一步開發利用小鉆提供依據。

1 材料與方法

1.1 試藥 小鉆藥材采自廣西壯族自治區金秀瑤族自治縣,經廣西中醫藥大學劉壽養教授鑒定為五味子科南五味子屬植物長梗南五味子(Kasdsura longipedunculataFinet et Gagnep)。取其干燥根和莖打成粗粉,用80%乙醇浸泡提取2次,每次7 d。回收乙醇,提取浸膏溶于適量水,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,并減壓濃縮得石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)、正丁醇提取物(C)和水提取物(D)。各組分均用0.5%羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC)溶液超聲溶解,分別配成50 mg·mL-1溶液,備用;阿司匹林腸溶片(拜耳醫藥保健有限公司,批號:BJ07490,使用時以純化水配成5 mg·mL-1);洛芬待因緩釋片(西南藥業股份有限公司,批號:121105);二甲苯(分析純,上海試劑一廠,批號:試-2005-06-12);冰醋酸(分析純,成都市科龍化工試劑廠,批號:20100111);改良Eagle培養基(Dulbecco's modified Eagle's Medium,DMEM)高糖培養基(北京Hyclone);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);一氧化氮試劑盒(碧云天生物技術研究所);脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),美國Sigma公司);四甲基偶氮唑藍(mmethyl thiazolyl tetrazolium,MTT,美國Sigma公司)。

1.2 動物 昆明種小鼠(SPF級),體質量(20±2)g,由廣西醫科大學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號:SCXK(桂)2012-0003。

1.3 細胞 RAW264.7小鼠巨噬細胞(購自中國科學院細胞庫)。

1.4 儀器 EYELA N-1100旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司),HX-T電子天平(慈溪市天東衡器廠),電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司),YLSQ4耳沖打孔器(淮北正華生物儀器設備有限公司), YLS-6B智能熱板儀(北京安得爾科技有限公司), DMI4000B倒置顯微鏡(德國Leica),BC-J80S50CO2培養箱(上海博訊),YXQ-LS-100SII高壓滅菌器(上海博訊),Infinite?F200 pro多功能酶標儀(瑞士Tecan)。

1.5 抗炎作用實驗

1.5.1 小鼠急性耳廓腫 取小鼠60只,雌雄各半,隨機分為6組,每組10只。即正常組(純化水),陽性對照組(阿司匹林50 mg·kg-1),小鉆石油醚組(A),小鉆乙酸乙酯組(B),小鉆正丁醇組(C),小鉆水提物組(D) (均含生藥量500 mg·kg-1),灌胃給藥,qd,連續給藥7 d,末次給藥后1 h,二甲苯0.1 mL均勻涂布于各鼠右耳正反面,左耳不處理,30 min后將小鼠處死,用8 mm打孔器在兩耳同一部位扎下左右耳片,精密稱質量,以右耳質量減去左耳質量,作為耳廓炎性腫脹度,計算右耳腫脹度及抑制率[2]。抑制率(%)=(空白組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白組平均腫脹度×100%。

1.5.2 棉球肉芽腫 取雄性小鼠60只,乙醚淺麻醉下腹部切口,將一個已高壓滅菌的棉球10 mg植入小鼠右側腋窩皮下。分組及給藥方法同“1.5.1”,連續7 d,末次給藥后1 h處死小鼠,剝離肉芽腫棉球,剔除脂肪組織,在70℃烘箱中干燥2 h后稱質量,減去原棉球質量即為肉芽腫質量[3],并計算抑制率。抑制率(%)=(空白組平均肉芽腫質量-給藥組平均肉芽腫質量)/空白組平均肉芽腫質量×100%。

1.5.3 細胞的培養 RAW264.7細胞在37℃、5%二氧化碳(CO2)條件下,用含10%胎牛血清、青霉素(100 U·mL-1)及鏈霉素(50 μg·mL-1)的DMEM高糖培養基培養,待細胞生長至對數期。

1.5.4 小鉆提取物對RAW264.7細胞活力的影響取處于對數生長期的RAW264.7細胞,胰酶消化,調整細胞懸液濃度為105個·mL-1,接種于96孔培養板中(每孔100 μL),培養24 h后,給藥,空白組加10%血清DMEM培養液,繼續放入培養箱培養24 h,取出培養板,各孔加入5 mg·mL-1MTT20 μL,放入培養箱中孵育4 h,棄去上清液,每孔加二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL,把96孔培養板置于酶標儀中震蕩10 min,波長492 nm處測量各孔吸光度(A)值,計算細胞相對抑制率[4]。細胞相對抑制率(%)= (1-實驗組A均值/對照組A均值)×100%。

1.5.5 小鉆提取物對RAW264.7細胞LPS刺激模型NO釋放的影響 將細胞培養至對數生長期,用0.25%胰蛋白酶消化105個·mL-1,接種于96孔培養板(每孔100 μL),培養24 h后,加入含小鉆萃取物的DMEM培養基(終濃度分別為50,100,200 μg·mL-1,每個劑量組復孔為8個),并加入LPS(終濃度1 μg·mL-1),同時設定空白組(加培養基)、模型組(加培養基和LPS)繼續孵育24 h,收集細胞培養上清液,按試劑盒說明書測定NO。

1.6 鎮痛作用

1.6.1 醋酸扭體法 取小鼠60只,雌雄各半,分組及給藥方法同“1.5”項,連續7 d,末次給藥后1 h腹腔注射0.7%醋酸溶液,每只0.4 mL。觀察并記錄注射醋酸溶液15 min內出現扭體反應的次數,計算藥物鎮痛百分率[5]。鎮痛百分率(%)=(空白組扭體次數-給藥組扭體次數)/空白組扭體次數×100%。

1.6.2 熱板法 選出對55℃熱板痛覺反應在10～30 s的雄性小鼠60只,隨機分為6組,每組10只。陽性組給予洛芬待因緩釋片(含磷酸可待因6.76 mg·kg-1),空白對照組給予同體積純化水,灌胃給藥,連續7 d,按0.5 g·kg-1劑量給藥,每只小鼠給藥前及末次給藥后30,60,90,120 min測定痛反應潛伏期,計算痛閾提高率[4]。

1.7 統計學方法 應用SPSS 17.0版統計軟件進行統計學處理,實驗數據用均數±標準差(±s)表示。各組間比較采用t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對小鼠耳廓腫脹的影響 從表1可知,B、C、D組二甲苯所致小鼠急性耳廓腫脹均被顯著抑制,其中C組抑制率55.83%,與純化水組比較,差異有統計學意義(P＜0.01),B組和D組與純化水組比較,均差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 6組小鼠耳廓腫脹實驗結果Tab.1 Results of auricle swelling test in six groups of mice ±s

表1 6組小鼠耳廓腫脹實驗結果Tab.1 Results of auricle swelling test in six groups of mice ±s

與純化水組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別小鼠/只劑量/(mg·kg-1)耳廓腫脹度/mg耳腫脹抑制率/%純化水組1009.08±4.020.00阿司匹林組10503.40±0.98*162.55 A組105008.57±1.665.61 B組105005.41±1.21*240.41 C組105004.01±1.20*155.83 D組105005.45±1.43*239.97

2.2 對小鼠棉球肉芽腫的影響 見表2。B、C、D組小鼠棉球肉芽腫均被抑制,與純化水組比較,均差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 6組小鼠棉球肉芽腫實驗結果Tab.2 Results of granuloma test induced by cotton ball in six groups of mice ±s

表2 6組小鼠棉球肉芽腫實驗結果Tab.2 Results of granuloma test induced by cotton ball in six groups of mice ±s

與純化水組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別小鼠/只劑量/(mg·kg-1)肉芽腫干重/mg抑制率/%純化水組10028.48±3.430.00阿司匹林組105021.21±3.14*125.53 A組1050025.74±3.189.58 B組1050022.44±3.88*221.21 C組1050024.12±3.44*215.31 D組1050023.02±3.83*219.17

2.3 小鉆提取物對RAW264.7細胞LPS刺激模型NO釋放的影響 見表3。石油醚提取物對細胞有很大毒性,故未繼續進行“1.5.5”項實驗。從表3可知,乙酸乙酯、正丁醇、水提取物均能顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放,顯示出一定的抗炎活性。

2.4 對小鼠醋酸性扭體反應的抑制作用 見表4,B、C、D組提取物均有鎮痛作用,能減少冰醋酸所致的小鼠扭體次數,其中C組15 min內扭體次數與純化水組比較,差異有統計學意義(P＜0.05),B組和D組15 min內扭體次數與純化水組比較,差異有統計學意義(P＜0.01)。

表3 5組RAW264.7細胞NO濃度測定結果Tab.3 Results of NO concentration in five group of RAW264.7 cells n=8,±s

表3 5組RAW264.7細胞NO濃度測定結果Tab.3 Results of NO concentration in five group of RAW264.7 cells n=8,±s

與模型組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別劑量/(μg·mL-1) NO濃度/(μmol·L-1)空白組07.82±0.30*1模型組09.36±0.29 B組2006.23±0.49*11006.17±0.80*1505.60±0.79*1C組2007.20±0.61*11006.94±0.66*1506.61±0.54*1D組2006.82±0.64*11007.01±0.88*1508.99±0.81

表4 6組小鼠扭體反應實驗結果Tab.4 Results of writhing test in six groups of mice ±s

表4 6組小鼠扭體反應實驗結果Tab.4 Results of writhing test in six groups of mice ±s

與純化水組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別小鼠/只劑量/(mg·kg-1) 15 min內扭體次數/次鎮痛率/%純化水組10033.3±5.30.00阿司匹林組105014.6±4.356.16 A組1050032.7±6.41.80 B組1050020.3±7.3*139.04 C組1050022.9±9.2*231.23 D組1050017.6±6.2*147.15

2.5 小鼠熱板法鎮痛作用 由表5可見,B組和C組熱板致痛鼠的痛閾值與給藥前相比,均顯著提高,B組小鼠給藥后90和120 min及C組小鼠給藥后120 min與給藥前比較,差異有統計學意義(P＜0.01),C組小鼠給藥60,90 min痛閾值與給藥前比較,差異有統計學意義(P＜0.05);相同時間B組小鼠給藥60 min和D組小鼠給藥后90和120 min痛閾值比純化水組顯著提高,差異有統計學意義(P＜0.05),相同時間B組小鼠給藥后90,120 min和C組小鼠給藥后60,90及120 min痛閾值比純化水組顯著提高,差異有統計學意義(P＜0.01)。

表5 6組小鼠熱板致痛反應實驗結果Tab.5 Results of hot plate-induced pain test in six groups of mice ±s,n=10

表5 6組小鼠熱板致痛反應實驗結果Tab.5 Results of hot plate-induced pain test in six groups of mice ±s,n=10

相同時間與純化水組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與本組給藥前比較,*3P＜0.01,*4P＜0.05Compared with purified water group at the same time,*1P＜0.05,*2P＜0.01;Compared with the same group before dosing,*3P＜0.01,*4P＜0.05

組別劑量/(mg·kg-1)給藥前痛閾值/s給藥后痛閾值/s 30 min60 min90 min120 min痛閾提高百分率/% 30 min60 min90 min120 min純化水017.4±5.614.0±5.515.1±3.113.5±7.216.8±8.40.00.00.00.0洛芬待因5020.0±7.815.3±5.122.3±6.5*135.8±9.8*2*328.0±7.9*10.011.579.040.0 A組50018.4±4.819.6±5.119.8±4.418.2±6.221.2±5.36.57.60.015.2 B組50020.6±8.014.4±5.026.0±11.4*136.0±9.0*2*339.8±12.8*2*30.026.274.893.2 C組50019.8±7.315.5±6.332.0±10.9*2*436.3±15.4*2*442.0±11.9*2*30.061.683.3112.1 D組50018.9±8.512.0±4.121.1±7.322.9±8.1*128.9±9.7*10.011.621.152.9

3 討論

筆者在本實驗中采用二甲苯致小鼠耳腫脹、小鼠棉球肉芽腫等體內實驗及各萃取物調節LPS誘導小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞分泌NO水平的體外實驗篩選抗炎活性部位。通過小鼠熱板法、醋酸扭體評價和比較了瑤藥小鉆不同溶劑提取物的抗炎鎮痛效果。小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎活性,能減少二甲苯致小鼠急性耳廓腫以及小鼠棉球肉芽腫的腫脹程度;小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物還具有明顯的鎮痛活性,能提高熱板致痛小鼠的痛閾,延緩熱板疼痛反應時間,減少冰醋酸刺激致痛小鼠扭體次數。實驗證明,小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎鎮痛活性。本研究為瑤藥小鉆的綜合開發利用和擴大藥源提供了科學的實驗依據。

[1] 戴斌.中國現代瑤藥學[M].南寧:廣西科學技術出版社, 2009:70-72.

[2] 唐炳蘭,陳路,李茂,等.五淋散膠囊藥效學研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(8):179-182.

[3] 陳建雙,張玉玲,趙波,等.赤雹根總皂苷抗炎作用研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(8):163-165.

[4] 蔡茁,俞發.木瓜提取物體內、體外抗炎鎮痛作用的實驗研究[J].中國中醫藥咨訊,2009,1(5):1-3.

[5] 唐炳蘭,繆劍華,程燕,等.壯瑤五驗方抗病毒、抗菌、解熱、鎮痛、消炎作用研究[J].廣西醫科大學學報,2008, 25(3):378-381.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.005

Anti-inflammation and Analgesic Effects of the Extracts from Kasdsura Longipedunculata Finet et Gagnep

MO Dan-dan,TANG Bing-lan,ZHOU Xiao-lei,WANG Shuo,LIU Zhen-jie,GU Xiao-yu,YUAN Jing-quan
(Natural Medicine Research Laboratory of Chemical Composition Institute of Guangχi Medicinal Plant,Nanning 530023,China)

Objective To screen the anti-inflammatory and analgesic extracts fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepand provide theoretic basis for its further exploitation and utilization.MethodsDifferent extracts(petroleum ether extract,ethyl acetate extract,n-butyl alcohol extract,water extract)were prepared.Mice were randomly divided into normal control,positive control with aspirin(50 mg·kg-1)or ibuprofen codeine(containing codeine 6.76 mg·kg-1),and petroleum ether,ethyl acetate,butanol,water extract groups(at 500 mg·kg-1each).Extracts or controls were intragastrically administered once daily for 7 consecutive days.The anti-inflammatory part fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepwas screened through xylene-induced ear edema,granuloma grew in mice,and nitric oxide(NO)level detection in macrophage RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide(LPS).The analgesic action of the extracts were tested with the hot plate method and acetic acid writhing in mice.ResultsAll of ethyl acetate extracts,n-butanol extracts and water extracts significantly inhibited the mice auricle swelling caused by xylene and cotton ball granuloma in mice(P＜0.05 orP＜0.01),and obviously reduced the NO release from LPS induced RAW264.7 cells(P＜0.01),which manifesting certain anti-inflammatory activity.The three extracts significantly decreased acetic acid-induced writhing,and attenuated hot plate induced pain by raising the pain threshold in mice (P＜0.05 orP＜0.01).ConclusionAll of the ethyl acetate extract,n-butanol extract,and water extract fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepexert anti-inflammatory and analgesic activity.

Bradawl;Anti-inflammation;Analgesia

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0291-04

2013-07-19

2013-08-20

*國家科技支撐計劃項目(2012BAI27B06);瑤藥創新體系建立及廣西民族醫藥產業化技術平臺建設(桂科能10100027-3);廣西生物醫藥創業服務平臺建設(桂科能10100024-4);廣西中醫藥管理局項目(GZZY13-35)

莫單丹(1980-),女,廣西那坡人,研究實習員,學士,研究方向:中藥藥理。電話:0771-2443036,E-mail：modan991220@163.com。

袁經權(1967-),男,廣西玉林人,副研究員,博士,研究方向:中藥新產品研發。電話:0771-5602461,E-mail：yjqgx@163.com。