白楊素誘導肝癌Hep3B細胞凋亡機制研究*

徐成坤，陽波，曹建國

(1.南華大學附屬第一醫院藥劑科，衡陽 421001;2.湖南師范大學醫學院藥理教研室，長沙 410000)

白楊素誘導肝癌Hep3B細胞凋亡機制研究*

徐成坤1，陽波1，曹建國2

(1.南華大學附屬第一醫院藥劑科，衡陽 421001;2.湖南師范大學醫學院藥理教研室，長沙 410000)

目的 研究白楊素誘導人肝癌Hep 3B細胞凋亡是否涉及激活ROS/ASK1/JNK/Bim信號通路。方法流式細胞術檢測細胞凋亡,siRNA轉染敲除細胞凋亡信號調節激酶1(ASK1)及Bim基因,SP600125抑制Jun氨基末端激酶(JNK),N-乙酰-L型半胱氨酸(NAC)清除活性氧(ROS),Western blot檢測蛋白表達。結果白楊素顯著誘導Hep 3B細胞凋亡,同時上調細胞p-ASK1、p-JNK1/2及Bim水平。NAC或SP600125預處理以及ASK1或Bim特異性siRNA轉染均能有效拮抗白楊素誘導的細胞凋亡。NAC預處理能抑制白楊素活化ASK1,NAC預孵育或ASK1特異性siRNA轉染能抑制白楊素活化JNK,NAC預孵育、ASK1特異性siRNA轉染或SP600125預處理均能拮抗白楊素上調Bim蛋白表達效應。結論白楊素可能通過刺激ROS的生成激活ASK1,導致JNK活化,進而上調Bim表達,并最終促進Hep 3B細胞凋亡。

白楊素；肝癌；細胞凋亡；細胞凋亡信號調節激酶1

白楊素(5,7-二羥基黃酮)是從紫葳科植物木蝴蝶中提取的一種對多種腫瘤細胞具有抑制作用的黃酮類化合物。楊小紅等[1]研究發現,白楊素通過活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生和持續的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)激活誘導人肝癌細胞凋亡。然而,白楊素誘導肝癌細胞凋亡的精確分子機制尚未完全闡明。細胞凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)是一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,參與多種生物學過程,包括細胞分化和凋亡[2-3]。已有研究報道ASK1能被包括ROS在內的許多刺激信號活化[4]。然而,ASK1在白楊素誘導肝細胞癌細胞凋亡中的作用仍然不清楚。Bim是一種促凋亡分子,是Bcl-2家族中僅含BH3結構域的新成員,Bim通過與Bcl-2和Bcl-XL結合,從而解除二者抑制凋亡作用,或者通過與Bax和Bak結合,促進細胞凋亡。同時,Bim表達水平能被JNK激酶激活c-Jun正調節[5-6],筆者在本研究中探討ROS/ASK1/JNK/Bim信號途徑在白楊素誘導肝癌Hep 3B細胞凋亡中所起的作用,為進一步闡明白楊素抗腫瘤作用的分子機制提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及試劑 用添加10%小牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養基培養人肝癌Hep 3B細胞系細胞(中國典型培養物保藏中心,中國武漢),并置于5%二氧化碳(CO2)、37℃增濕環境中孵育。白楊素購自美國Sigma化學公司。用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)作為溶劑溶解白楊素,培養體系中DMSO的最高終濃度為0.1%。DMEM培養基,小牛血清(calf serum,CS),青霉素/鏈霉素和OptiMEM,脂質體plusTM試劑購自美國Invitrogen公司。JNK1的磷酸化1/2(Thr183/Tyr185)和JNK1的特異性抗體分別購自美國New England Biolabs公司。磷酸化的ASK1,ASK1和Bim的特異性抗體,辣根過氧化物酶標記的抗小鼠和抗兔IgG抗體購自美國Santa Cruz生物技術公司。增強化學發光檢測試劑購自美國PerkinElmer Life Sciences公司。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的所有材料來自美國Bio-Rad公司。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl cysteine, NAC)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、胃蛋白酶抑制劑、亮肽素、其他化學品,獲自美國Sigma公司。

1.2 流式細胞術分析 細胞培養在6孔細胞培養板中。細胞融合后,用不同的siRNA轉染細胞48 h或使用特異性抑制劑預處理1 h,白楊素(40 μmol·L-1)處理24 h。收集細胞,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS),氯化鈉137 mmol·L-1,氯化鉀2.7 mmol·L-1,磷酸氫二鈉4.3 mmol·L-1和磷酸二氫鉀1.5 mmol·L-1,pH7.4)洗滌細胞2次,并重新置于冰冷的70%乙醇中-20℃過夜。用含50 mmol·L-1磷酸氫二鈉、25 mmol·L-1檸檬酸和0.1%Triton X-100的0.4 mL磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(pH7.8)洗滌細胞2次,并隨之用含0.5%Triton X-100,10 mmol·L-1哌嗪-1,4-二乙磺酸(piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid,PIPES),100 mmol·L-1氯化鈉,2 mmol·L-1氯化鎂,0.1 U·mL-1RNase A,and 25 μg·mL-1PI的1.5 mL PI染色緩沖液在流式細胞分析前避光染色30 min。使用流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)和Cellquest程序(美國Pharmingen BD Bioscience公司)進行DNA含量分析。

1.3 小干擾RNA轉染 為了瞬時siRNA轉染,細胞以1×106個·mL-1接種于6孔細胞培養板上并培養過夜。翌日,用包含每孔100 ng的ASK1和Bim特異性siRNA或非特異性對照小干擾RNA(siRNA,美國Santa Cruz生物技術公司)的脂質體plusTM試劑轉染細胞。siRNA寡核苷酸的序列為非特異性對照siRNA(5′-GACGCGATCAGAGAGTAAT-3′),ASK1特異性siRNA(5′-GGTGGCACAAGCAAGTTCT-3′)和Bim特異性siRNA(5′-GATCCGTTCTGAGTGTGACCGAGA-3′)。用每種siRNA轉染細胞并孵育48 h。通過抗ASK1和Bim抗體的免疫印跡分析確定對ASK1和Bim蛋白表達的干擾效果。

1.4 蛋白質免疫印跡分析 蛋白質免疫印跡按照YANG等[1]報道的方法完成。抗JNK1、磷酸化JNK1/2、磷酸化ASK1、ASK1、Bim和β-actin抗體作為一抗。使用電化學發光(electrochemiluminescence,ECL)高級蛋白質印跡分析系統(美國Amersham Pharmacia Biotech公司)檢測信號。

1.5 統計學方法 實驗數據錄入SPSS15.0版for windows evaluation軟件,建立數據庫,各組實驗數據用均數±標準差(±s)表示,用One Way ANOVA方式行方差分析。對照組均數與實驗組均數間的比較用LSD法,P＜0.05為差異有統計學意義。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡涉及激活ASK1流式細胞術分析結果顯示,siRNA敲除ASK1可有效減弱40 μmol·L-1白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡作用(圖1A)。免疫印跡檢測ASK1磷酸化蛋白水平,發現40 μmol·L-1白楊素處理的Hep 3B細胞中ASK1磷酸化蛋白水平增加(圖1B)。提示ASK1活化可能參與了白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡。

圖1 白楊素誘導肝癌Hep 3B細胞凋亡涉及上調ASK1 (n=3)A.ASK1特異性小干擾RNA抑制白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡率(Sub-G1 population)增高效應。與對照組比較,*1P＜0.01,*3P＜0.05;與白楊素+siRNA ASK1干預組比較,*2P＜0.05;B.Western blot分析白楊素對磷酸化ASK1(p-ASK1)、總ASK1(t-ASK1)蛋白表達(β-actin為內參)Fig.1 Chrysin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma Hep 3B cells involving upregulation of ASK1(n=3)A.Inhibition of ASK1 specific small interfering RNA on chrysin-induced apoptosis rate(Sub-G1 population)of Hep 3B cells. Compared with the control group,*1P＜0.01,*3P＜0.05;compared with chrysin plus ASK1 iRNA intervention group,*2P＜0.05 0.05;B.Western blot analysis on the effect of chrysin on the expression of phosphorylation ASK1(p-ASK1),total ASK1(t-ASK1)protein(β-actin as reference)

2.2 白楊素活化ASK1涉及ROS形成 流式細胞計數分析顯示,抗氧化劑NAC預處理Hep 3B細胞可顯著抑制白楊素誘導細胞凋亡作用(圖2A)。此外,免疫印跡分析表明,10 mmol·L-1NAC預處理抑制白楊素增加ASK1磷酸化水平作用(圖2B)。提示白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡可能通過產生ROS,繼而活化ASK1所介導。

2.3 白楊素誘導Hep 3B細胞JNK活化涉及ROS和ASK1 免疫印跡分析表明,白楊素可增高JNK1/2蛋白磷酸化水平,而對其總蛋白水平無影響(圖3A),再次證實白楊素通過活化JNK方式介導Hep 3B細胞凋亡[1]。而NAC預處理可拮抗白楊素激活JNK(圖3A)。同樣,用ASK1特異性siRNA預處理也可拮抗白楊素激活JNK效應(圖3B)。因此,這些發現提示,白楊素誘導Hep 3B細胞JNK1/2活化需要ROS-ASK1級聯介導。

圖2 白楊素激活Hep 3B細胞ASK1涉及ROS形成(±s,n=3)A.NAC抑制白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡率(Sub-G1 population)增高作用。與對照組比較,*1P＜0.01,*3P＜0.05;與Chrysin+NAC組比較,*2P＜0.05;B.Western blot分析NAC對chrysin活化ASK1的影響(β-actin為內參)Fig.2 Chrysin-induced ASK1 activation in Hep 3B cells involving ROS formation(±s,n=3)A.Inhibition of NAC on chrysin-induced apoptosis rate(Sub-G1 population)of Hep 3B cells.Compared with the control group,*1P＜0.01,*3P＜0.05;compared with chrysin plus NAC group,*2P＜0.05;B.Western blot analysis on the effect of NAC on ASK1 activation by chrysin(β-actin as reference)

2.4 白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡涉及上調Bim 流式細胞術分析顯示,siRNA敲除Bim顯著抑制白楊素誘導細胞凋亡作用(圖4A)。免疫印跡分析表明,白楊素上調Bim蛋白表達,NAC、ASK1特異性siRNA及JNK抑制劑SP600125具有拮抗白楊素上調Bim蛋白表達作用(圖4B)。提示白楊素誘導Hep 3B細胞Bim蛋白表達涉及ROS-ASK1-JNK級聯。

圖3 白楊素激活Hep 3B細胞JNK涉及ROS形成和激活ASK1A.Western blot分析NAC抑制白楊素活化JNK1/2作用; B.Western blot分析ASK1特異性小干擾RNA(si RNA)對白楊素活化JNK1/2作用的影響Fig.3 Chrysin-induced JNK activation in Hep 3B cells involving ROS formation and ASK1 activationA.Western blot analysis on the inhibition of NAC on JNK1/2 activation by chrysin;B.Western blot analysis on the effect of specific small interfering RNA of ASK1 on JNK1/2 activation by chrysin

圖4 白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡涉及上調Bim(n=3)A.Bim特異性小干擾RNA(si RNA)拮抗白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡率(Sub-G1 population)增高作用,與對照組比較,*1P＜0.01,*3P＜0.05;與Chrysin+siRNA Bim組比較,*2P＜0.05;B.Western blot分析NAC、siRNA ASK1、JNK特異性阻斷劑SP600125對chrysin誘導Bim蛋白表達的影響Fig.4 Chrysin-induced apoptosis of Hep 3B cells involving upregulation of Bim(n=3)A.Inhibition of specific small interfering RNA of Bim(SiRNA)on chrysin-induced apoptosis rate(Sub-G1 population)of Hep 3B cells.Compared with the control group,*1P＜0.01,*3P＜0.05;compared with chrysin plus Bim iRNA group,*2P＜0.05; B.Western blot analysis on the effect of NAC,ASK1 siRNA and SP600125,a specific blocker of JNK on chrysin-induced the expression of Bim protein

3 討論

本研究結果顯示,白楊素通過激活ROS-ASK1-JNK信號級聯上調Bim蛋白表達,誘導Hep 3B細胞凋亡。

活化的ASK1通過刺激下游信號事件,包括MKK4/7和激活JNK,在調節各種生物學過程包括細胞分化和凋亡中扮演重要角色[7]。JNK被認為是ASK1激活后發揮作用的靶基因[8]。然而,ASK1-JNK信號通路是否參與白楊素誘導肝癌細胞凋亡還沒有闡明。在本實驗中筆者發現,白楊素處理Hep 3B細胞導致ASK1、JNK依次激活,而且ASK1特異性siRNA和JNK抑制劑(SP600125)有效地拮抗白楊素誘導細胞凋亡。ASK1特異性siRNA抑制白楊素誘導JNK1/2活化。此外,白楊素誘導Bim蛋白表達的作用亦被ASK1特異性siRNA和JNK抑制劑所抑制。這些結果顯示白楊素可能通過活化ASK1激活JNK,而JNK激酶活化后激活c-Jun上調Bim蛋白表達,并最終引起Hep 3B細胞凋亡。

許多研究顯示,ROS可能通過氧化TRX和GRX活化ASK1[2-3]。最近的報道顯示,ASK1通過減少967絲氨酸磷酸化同時于抑制蛋白解離增加來響應氧化應激如過氧化氫(H2O2),導致細胞凋亡功能增強[9]。在本實驗中,筆者發現NAC抑制白楊素誘導ASK1活化、JNK活化、Bim蛋白表達和細胞凋亡。這些發現顯示ROS可能在白楊素誘導ASK1活化和后續的信號事件中起關鍵作用。

Bcl-2家族蛋白通過抗凋亡和促凋亡因子調節線粒體觸發凋亡途徑,決定細胞的生或死。Bim作為Bcl-2家族的促凋亡成員,通過破壞線粒體完整性導致細胞凋亡。有研究表明,Bim基因表達能響應選擇性的應激信號[10]。在本研究中,筆者發現白楊素誘導Bim表達并且Bim特異性siRNA拮抗白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡,這些結果提示Bim表達與白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡可能呈因果關系。此外,抗氧化劑NAC、JNK抑制劑(SP600125)和ASK1特異性siRNA抑制白楊素誘導Bim表達。因此,筆者認為白楊素通過激活ROS-ASK1-JNK信號級聯,上調Bim表達,并最終誘導Hep 3B細胞凋亡。最近的報道顯示,除了Bim外,其他Bcl-2家族成員也參與白楊素誘導癌細胞凋亡過程[11]。這些發現,至少部分說明,為什么阻斷ASK1信號級聯沒能完全消除白楊素誘導Hep 3B細胞凋亡效應。

總之,本實驗結果首次證明白楊素誘導人肝癌Hep3B細胞凋亡的分子機制涉及激活ROS-ASK1-JNK信號級聯促進Bim蛋白表達。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.006

Investigation of Mechanism Underlying Chrysin-induced Apoptosis in Hepatocellular Carcinoma Hep3B Cells

XU Cheng-Kun1,YANG bo1,CAO Jian Guo2
(1.Pharmaceutical Preparation Section,the First Affiliated Hospital,the University of South China,Hengyang 421001,China;2.Hunan Normal University School of Medicine Pharmacology Teaching and Research Section,Changsha 410000,China)

Objective To investigate whether the apoptosis induced by chrysin in hepatocellular carcinoma Hep 3B is involved in activation of ROS/ASK1/JNK/Bim signal pathway.MethodsApoptosis was examined using flow cytometry. Apoptosis signal-regulating kinase 1(ASK1)and Bim genes were knocked out by small interfering RNA(siRNA)transfection. Reactive oxygen species(ROS)and c-Jun N-terminal kinase(JNK)activity were suppressed by their specific inhibitorsN-acetyl-L-cysteine(NAC)and SP600125,respectively.The protein expression was detected by western blot analysis.ResultsChrysin significantly induced apoptotic cell death and was able to up-regulate the levels of p-ASK1,p-JNK1/2 and Bim in Hep 3B cells.However,the apoptosis induced by chrysin would be effectively suppressed by pretreatment with NAC or SP600125 and transfected with ASK1-specific siRNA or Bim-specific siRNA.Accordingly,pretreatment with NAC could suppress chrysinmediated ASK1 activation;Pretreatment with NAC or transfected with ASK1-specific siRNA could suppress JNK activation;and pretreatment with NAC or SP600125 and transfected with ASK1-specific siRNA could suppress chrysin-induced Bim expression.ConclusionChrysin might activate ASK1 through ROS production to cause JNK activation,which in turn induces Bim expression,and ultimately results in Hep 3B cell apoptosis.

Chrysin;Hepatocellular carcinoma;Apoptosis;Apoptosis signal-regulating kinasel

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0295-04

2013-08-05

2013-09-10

*國家自然科學基金資助項目(NO.09A054)

徐成坤(1963-),男,湖南邵陽人,副主任藥師,主要從事醫院藥學管理與臨床藥學工作。電話:0734-8578926,E-mail：ckx1881@163.com。