雷公藤甲素對胰腺癌干細胞的影響

盛健，吳峰，夏甘霖，羅力，劉光華，潘華鋒，吳遠志，王旭

(武鋼第二職工醫院外科，武漢 430085)

雷公藤甲素對胰腺癌干細胞的影響

盛健，吳峰，夏甘霖，羅力，劉光華，潘華鋒，吳遠志，王旭

(武鋼第二職工醫院外科，武漢 430085)

目的 探討雷公藤甲素(TPL)對胰腺癌干細胞的影響。方法利用不同濃度TPL處理人胰腺癌細胞PANC-1,流式細胞術檢測胰腺癌干細胞相關分子CD44、CD24、ESA、CD133及ALDH1表達,流式分選表型的PANC-1細胞作為干細胞,再分別通過體外細胞球體形成實驗及NOD/SCID小鼠體內移植瘤成瘤實驗,驗證TPL對胰腺癌干細胞成球及成瘤能力的影響。結果10,25 nmol·L-1TPL可抑制PANC-1細胞表面CD44、CD24、CD133及ALDH1表達,并可以抑制胰腺癌干細胞成球能力[對照組成球(30±4)個,5 nmol·L-1TPL組(13±2)個,10 nmol·L-1TPL組(5±1)個,P＜0.01]及成瘤能力(抑瘤率76.5%)。結論TPL能夠抑制胰腺癌干細胞功能,可能是其抑制胰腺癌的機制之一。

雷公藤甲素；癌,胰腺；干細胞

胰腺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤,目前發病率呈上升趨勢。因胰腺癌早期診斷困難,手術風險高而效果較差,也缺乏有效的化學治療(化療)藥物,且對放射治療(放療)不敏感,在消化系統腫瘤中預后最差,總體五年生存率不足5%[1]。腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)是一類具有自我更新與增殖分化潛能的細胞,在特定條件下可以形成不同分化程度的腫瘤細胞,被認為在腫瘤發生發展、耐藥、轉移與復發中發揮重要作用[2-3]。胰腺癌干細胞近年來成為研究的熱點,目前研究表明,表型的胰腺癌細胞可能具有干細胞特性,而CD133、乙醛脫氫酶1 (Aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)等也可作為富集胰腺癌干細胞的標志[3-5]。雷公藤甲素(triptolide, TPL)是從衛矛科植物雷公藤中提取出的一種活性物質,是雷公藤的主要有效成分,在體內化學性質穩定。近年來研究發現,TPL具有明顯的抑制胰腺癌細胞增殖,誘導胰腺癌細胞凋亡的作用,也可顯著增強胰腺癌細胞對放療和化療的敏感性[6-8]。但TPL是否可以影響胰腺癌干細胞的數量及功能,目前尚不清楚。筆者在本實驗中擬通過TPL干預人胰腺癌細胞PANC-1,探討TPL對胰腺癌干細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞 人胰腺癌細胞PANC-1由本醫院實驗室傳代所得,培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中,置于37℃、5%二氧化碳溫箱內。

1.2 主要試劑 抗CD44、CD24、ESA及ALDH1抗體均購自美國BD公司(貨號依次為559942,555428, 347197,611195),CD133購自德國美天旎公司(貨號: 130-080-801)。實驗動物非肥胖性糖尿病聯合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠,雌性,8周齡,體質量20～24 g,購自武漢大學動物實驗中心,實驗動物許可證號: SCXK(鄂)2008-0004,置于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心SPF級動物中心飼養。

1.3 流式細胞術檢測 將對數生長期的PANC-1細胞接種于6孔板,細胞融合度達到50%～60%時改用無血清培養基孵育24 h后,按梯度每孔加入不同濃度(10或25 nmol·L-1)TPL,對照組加入等量二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。24 h后收集細胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌兩次,分別標記CD44、CD24、ESA、CD133及ALDH1,利用FACSCalibur檢測并分析。

1.4 體外細胞球體形成實驗 利用CD44、CD24、ESA 3種抗體流式分選表型的PANC-1細胞作為干細胞,以每孔1 000個的密度接種于含有干細胞培養液[含10 ng·mL-1成纖維細胞生長因子、20 ng·mL-1表皮生長因子、5 μg·mL-1胰島素、2.75 mg·mL-1轉鐵蛋白及2.75 μg·mL-1硒(ITS)]的超低吸附24孔板(康寧)中,每孔給予不同濃度TPL,培養14 d,普通光學顯微鏡下計數克隆形成個數。

1.5 NOD/SCID小鼠體內移植瘤成瘤實驗 將上述分選所得干細胞計數,以每只5×103個接種于NOD/SCID小鼠右腹部皮下,15 d后均出現肉眼可見的皮下移植瘤,利用游標卡尺測定瘤體大小,計算體積,挑選12只瘤體體積和體質量接近的小鼠,隨機分為兩組,每組6只,實驗組給予0.25 mg·kg-1·d-1TPL,皮下腫瘤周圍注射給藥,連續給藥15 d;對照組給予含等量DMSO的0.9%氯化鈉溶液。每隔3 d測量移植瘤體積1次并記錄。第15天停藥,第16天處死裸鼠,仔細剝離瘤塊并稱質量,按下列公式計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(對照組平均瘤質量-實驗組平均瘤質量)/對照組平均瘤質量×100%。

2 結果

2.1 TPL可降低PANC-1細胞中胰腺癌干細胞標志的表達 PANC-1細胞在TPL(10或25 nmol·L-1)或等量DMSO作用24 h后,分別標記CD44、CD24、ESA、 CD133及ALDH1抗體,流式細胞術檢測及ALDH1的表達,結果見表1。TPL可降低PANC-1細胞中及ALDH1+表達,且差異有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。但TPL對ESA的表達沒有顯著性影響。

3 討論

腫瘤干細胞理論于1997年提出,BONNET等[2]從人急性髓性細胞白血病患者中發現并成功分離出腫瘤干細胞。相對于血液系統腫瘤,實體瘤中的干細胞較難分離及研究。2003年,AL-HAJJ等首次從人類乳腺腫瘤中分離出一群細胞,并通過將該種細胞接種至NOD/SCID小鼠身上,發現100個細胞就可以100%成瘤,從而為實體瘤干細胞研究打開了局面[9]。LI等[4]于2007年在胰腺癌中篩選出細胞,并發現這群細胞具有自我更新、多向分化潛能及極強的成瘤能力,從而把CD44、CD24及ESA 3個指標作為分選富集胰腺癌干細胞的重要標志。隨著研究的深入,其他一些細胞表面蛋白如CD133、ALDH1等也被認為與胰腺癌干細胞相關,并且發現利用不同表面分子分選的干細胞群之間有一定的交集,從而為人們理解干細胞的定義和功能提供了新的方向[3,5]。

表1 TPL可降低PANC-1細胞中胰腺癌干細胞標志表達情況Tab.1 Expression decline of pancreatic cancer stem cell markers in PANC-1 cells at the presence of TPL %

目前人們認為腫瘤干細胞與腫瘤的發生發展關系密切,尤其在惡性腫瘤化療耐藥復發等進程中發揮重要作用[3,10]。TPL作為祖國傳統中藥雷公藤的主要活性成分,研究表明對多種腫瘤細胞具有較強的抑制作用,能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[11]。既往研究也發現TPL對胰腺癌細胞具有阻斷細胞周期、抗細胞增殖和促進細胞凋亡的作用,TPL同時還可以增加胰腺癌對放療或化療的敏感性[8,12],但TPL抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲的具體機制尚不清楚。

筆者在本實驗中通過流式細胞學檢測發現,TPL可以降低PANC-1細胞中某些與胰腺癌干細胞相關的表達,提示TPL可能通過干預胰腺癌干細胞從而發揮抑制胰腺癌的作用。進而,筆者利用作為標志流式分選富集PANC-1中的胰腺癌干細胞,并通過體外細胞球體形成實驗及體內移植瘤成瘤實驗進一步驗證了TPL對于胰腺癌干細胞的成球及成瘤能力具有明顯的抑制作用,從而為TPL應用于臨床胰腺癌的治療提供了一定的理論基礎。而且筆者發現TPL對于PANC-1細胞中的Wnt/β-catenin信號通路有一定的影響(結果未列出),而既往研究表明Wnt/β-catenin在維持干細胞干性的過程中發揮重要作用[13]。TPL是否通過Wnt/β-catenin調節胰腺癌干細胞的功能,有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.011

Effect of Triptolide on Pancreatic Cancer Stem Cells

SHENG Jian,WU Feng,XIA Gan-lin,LUO Li,LIU Guang-hua,PAN Hua-feng,WU Yuan-zhi,WANG Xu
(Department of Surgery,the Second Worker Hospital of Wuhan Iron and Steel Company,Wuhan 430085,China)

Objective To investigate the effect of triptolide on pancreatic cancer stem cells.MethodsHuman pancreatic cancer cells PANC-1 were treated with different doses of triptolide.Pancreatic cancer stem cell markers including CD44, CD24,ESA,CD133 and ALDH1 were measured by flow cytometry.ESA+PANC-1cells were sorted as pancreatic cancer stem cells.Cell spheres formationin vitroand xenografts tansplantation in NOD/SCID mice were tested to detect the effect of triptolide on pancreatic cancer stem cells.ResultsTriptolide reduced the expression of CD44,CD24,CD133 and ALDH1 in PANC-1,significantly inhibitted the ability of spheres formation(counts of spheres:30±4 in the control,13±2 in TPL at 5 nmol ·L-1and(5±1)in TPL at 10 nmol·L-1,P＜0.01),and reduced xenografts formation by 76.5%.ConclusionTriptolide could restrain the function of pancreatic cancer stem cells,which may account for the inhibition effect of triptolide on pancreatic carcinoma.

Triptolide;Pancreatic carcinoma;Cancer stem cell

R735.9;R965

A

1004-0781(2014)03-0315-03

2013-06-01

2013-07-12

盛健(1977-),男,湖北武漢人,主治醫師,研究方向:胃腸道腫瘤。E-mail：66353327@qq.com。

王旭(1965-),男,河北石家莊人,主任醫師,碩士,研究方向:胃腸道腫瘤。E-mail：zhaohmwx@163.com。