純陽正氣膠囊抑制幽門螺桿菌作用研究

馮青，劉偉，蘇楠，吳新榮

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣州 510640;2.廣州軍區廣州總醫院藥學部，廣州 510010;3.南方醫科大學藥學院，廣州 510515;4.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510405)

純陽正氣膠囊抑制幽門螺桿菌作用研究

馮青1，2，劉偉2，3，蘇楠2，4，吳新榮2

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣州 510640;2.廣州軍區廣州總醫院藥學部，廣州 510010;3.南方醫科大學藥學院，廣州 510515;4.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510405)

目的 考察純陽正氣膠囊對幽門螺桿菌(Hp)的體外抑制作用。方法采用紙片擴散法、微量倍比稀釋法觀察純陽正氣膠囊對Hp的抑菌圈與吸光度(A)值。結果紙片擴散法實驗中,Hp對濃度≥0.05 g·mL-1純陽正氣膠囊藥液為中敏;通過測定菌液的A值,確定0.4,0.2,0.1 g·mL-1(按生藥計)純陽正氣膠囊藥液的抑菌率分別為76.01%, 69.83%,48.52%,與陰性對照比較,均差異有統計學意義。結論純陽正氣膠囊對Hp具有一定的體外抑制作用。

純陽正氣膠囊；幽門螺桿菌；抑菌作用,體外

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是一種微需氧性革蘭陰性桿菌,傳染性強,感染后可寄生于人胃和十二指腸黏膜,引發消化性潰瘍、非潰瘍性消化不良[1],也是引發胃癌和低度胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的重要致病因素[2]。目前,廣泛采用以抗菌藥物、質子泵抑制藥、鋁酸鉍制劑為主的三聯或四聯方法[3],但在治療過程中,廣泛使用抗菌藥物,Hp會出現耐藥性[4]。耐藥菌株的出現已成為藥物根除Hp成功率下降的主要因素。文獻報道,一些單味中藥[5],如蒼術[6]、陳皮[7]、丁香[8],及中藥復方如除幽湯[9](處方由茯苓、白術、法半夏等組成)、胃喜康煎劑[10](由茯苓、丹參等組成)在一定濃度下具有抑制Hp作用。純陽正氣膠囊由廣藿香、半夏、土木香、陳皮、丁香、肉桂、蒼術、白術、茯苓、朱砂、硼砂等組成,筆者在本實驗中對該藥進行體外抑制Hp作用研究。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養鑒定 Hp(ATCC43504)購自廣州微生物研究所。培養基為含5%的脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂,在37℃微需氧環境[85%氮氣(N2)、10%二氧化碳(CO2)、5%氧氣(O2)培養72 h。菌株經菌落特征、菌體形態、生理生化鑒定為Hp菌株。

1.2 藥物 純陽正氣膠囊(合肥立方制藥股份有限公司,批號:110201)。陽性對照藥阿莫西林(石藥集團中諾藥業有限公司,規格:按C16H19N3O5S計,每粒0.25 g,批號:160110215)。

1.3 試劑及設備 哥倫比亞瓊脂培養基、腦-心浸出液肉湯(brain heart infusion broth,BHI,廣東環凱微生物科技有限公司),無菌脫纖維羊血,微需氧產氣袋(英國OXOID公司),CW-CJ-2F凈化工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司),LRH-250A生化培養箱(廣東醫療器械廠),ZHWY-200B恒溫培養振蕩器,酶標儀(MULTISKAN GO Thermo scientific)。

1.4 藥液的制備 純陽正氣膠囊去膠囊后用鈷60(60Co)消毒,采用半仿生法原理溶解藥物,模擬口服給藥及藥物經胃腸道轉運原理,用pH為3.0的純化水將藥物粉末超聲溶解,過濾,未溶解藥物粉末用pH 7.0的純化水進行超聲溶解,過濾,每次超聲時間為35 min,混合兩次濾液,調pH為中性。藥液濃度為0.4 g·mL-1(按生藥計)。將中性藥液以培養液倍比稀釋(1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32),備用。阿莫西林采取相同方法處理。

1.5 菌懸液的制備 將接種3 d的Hp用無菌0.9%氯化鈉溶液洗下,加入腦心浸出液肉湯配成腦心浸液Hp菌懸液,用標準比濁管進行比濁,校正菌液濃度,使菌液濃度達到1×108CFU·mL-1。

1.6 抑菌實驗

1.6.1 紙片擴散法 取Hp懸液100 μL,均勻涂于含5%脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂培養基平板上,于37℃微需氧環境(85%N2、10%CO2、5%O2)平衡0.5 h。取直徑6 mm圓形滅菌濾紙片,浸入梯度濃度藥液、阿莫西林藥液、陰性對照溶液(滅菌的中性純化水),1 h,取濾紙片3張,平貼于涂布菌株的平皿內,置于37℃微需氧環境內培養72 h,觀察結果,取出,計算抑菌圈(包括紙片)直徑。取3張抑菌圈的平均直徑。陽性對照阿莫西林濃度分別為0.125, 0.062 5 g·mL-1。判斷標準:抑菌圈直徑＞20 mm為極敏,抑菌圈直徑15～20 mm為高敏,抑菌圈直徑10～15 mm為中敏,抑菌圈直徑＜10 mm為低敏,無抑菌圈為不敏感。

1.6.2 微量倍比稀釋法 取96孔微量培養板,于1～5孔加入倍比稀釋的梯度濃度藥液,每孔的藥量均為100 μL,將配好的菌懸液用液體培養基稀釋1 000倍,使Hp菌懸液的濃度為1×105CFU·mL-1。用微量移液器將菌懸液100 μL加入對應區的各實驗孔中,將孔內液體充分混勻,此時各孔含液200 μL,藥物濃度為0.2,0.1,0.05,0.025,0.012 5 g·mL-1。陰性對照孔加入液體培養基200 μL,陽性對照孔加入菌懸液100 μL和含陽性對照藥液體培養基100 μL,根據“1.6.1”項結果,純陽正氣膠囊內容物藥液濃度在0.012 5 g·mL-1時,對Hp無抑菌性,故在此方法中,陽性對照藥選擇對菌株有高敏性的0.125 g·mL-1的藥液。將接種好的微量培養板置于37℃微需氧環境中培養72 h。以上實驗過程重復3次。酶標儀測定吸光度(A)值:上述微量培養板于37℃培養箱培養72 h后,用酶標儀于540 nm處測各孔A值,與陽性對照孔對比,計算各濃度藥液對Hp的抑菌率。

1.7 統計學方法 抑菌率計算公式:抑菌率(%)= (陽性對照A值-實驗A值)/(陽性對照A值-陰性對照A值)×100%。實驗數據均以均數±標準差(±s)表示,并采用SPSS 17.0版統計軟件進行單因素方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紙片擴散法抑菌結果 結果表明,幽門螺桿菌對0.05 g·mL-1藥液有一定的敏感性。

表1 不同濃度藥液的抑菌圈直徑及敏感性Tab.1 Inhibition zone diameters and sensitivities of different concentrations of solutions mm,±s,n=3

表1 不同濃度藥液的抑菌圈直徑及敏感性Tab.1 Inhibition zone diameters and sensitivities of different concentrations of solutions mm,±s,n=3

組別濃度/(g·mL-1)抑菌圈/mm 敏感性純陽正氣膠囊藥液0.213.1±0.265中敏0.111.5±0.153中敏0.0510.5±0.115中敏0.0257.8±0.153低敏0.012 50.0±0.0不敏感陰性對照0.00.0±0.0不敏感陽性對照0.12518.7±0.265高敏0.062 510.9±0.187中敏

2.2 微量倍比稀釋法抑菌結果 結果表明藥液濃度>0.1 g·mL-1具有體外抑制Hp的作用,見表2。與陰性對照相比,濃度≥0.1 g·mL-1的藥液(按生藥計)對Hp有抑制作用。

表2 Hp在不同濃度藥液中生長72 h后的A值及抑菌率Tab.2 A values and bacteriostasis rate on H.pylori 72 hours after growth in different concentration of solutions ±s,n=3

表2 Hp在不同濃度藥液中生長72 h后的A值及抑菌率Tab.2 A values and bacteriostasis rate on H.pylori 72 hours after growth in different concentration of solutions ±s,n=3

與陰性對照組比較,*1P＜0.05Compared with negative control group,*1P＜0.05

組別濃度/(g·mL-1)A值抑菌率/%純陽正氣膠囊藥液0.40.482 4±0.011 1*176.01 0.20.517 8±0.006 0*169.83 0.10.639 9±0.011 7*148.52 0.050.871 4±0.018 28.10 0.0250.911 5±0.001 81.09陰性對照0.00.917 8±0.001 80.00陽性對照0.1250.341 7±0.010 2100.00

3 討論

本實驗結果表明,純陽正氣膠囊對Hp標準菌株有一定的抑制作用,其藥液濃度與抑菌效果呈正相關, 0.2 g·mL-1藥液對Hp為中敏,0.012 5 g·mL-1藥液對Hp無抑制作用。對菌株有中敏感性的藥液,與陰性對照比較,0.4,0.2,0.1 g·mL-1藥液(按生藥計)對實驗菌有抑制作用,結果表明,微量倍比稀釋法可更準確判斷不同濃度藥液的抑菌率,因此純陽正氣膠囊在臨床應用中要注意有效藥物濃度。

組成純陽正氣膠囊的16味中藥中,廣藿香和半夏兩藥為主藥。廣藿香歸脾胃、肺經,辛者散邪行氣行濕,溫者祛寒。體外實驗證明,廣藿香中的藿香酮對大腸桿菌有抑制作用。半夏歸脾、胃、肺經,以燥濕化痰、降逆止嘔為特點,是止吐的良藥,尤其適宜于寒濕所致的嘔吐,純陽正氣膠囊治療急性胃腸炎具有療效好、奏效快的特點,不增加胃腸負擔,無毒副作用[11]。目前Hp對抗生素的耐藥性增加,中藥治療中感染副作用小,不產生耐藥性,使該復方膠囊具有開發用于治療Hp感染的前景。有文獻報道,蒼術[6]、陳皮[7]、丁香[8]等具有體外抑菌作用,而本實驗所用復方中含有此類具有抑菌作用的中藥成分。

[1] 李宜輝,張朋彬,郭紅,等.根除幽門螺桿菌對功能性消化不良的作用[J].第三軍醫大學學報,2004,26(11): 1013-1015.

[2] MCGOWAN C C,COVER T L,BLASER M J.Helicobacter pyloriand gastric acid:biological and therapeutic implications[J].Gastroenterology,1996,110(3):926-938.

[3] AXON A T,MOAYYEDI P.Eradication ofHelicobacter pylori:Omeprazole in combination with antibiotics[J].Scand J Gastroenterol Suppl,1996,215:82-89.

[4] SHARARA A I.,CHEDID M,ARAJ G F,et al.2002 Prevalence ofHelicobacter pyloriresistance to metronidazole, clarithromycin,amoxycillin and tetracycline in Lebanon [J].Inter J Antimicro Agents,2002,19(2):155-158.

[5] 王緒霖,繳穩玲,呂宗舜,等.抑制Hp中藥的初步篩選[J].中國中西醫結合雜志,1994,14(9):534.

[6] 胡定慧,趙曉姬,單志萍,等.蒼術體外抑菌活性的初步研究[J].生物加工過程,2008,6(5):60-63.

[7] 嚴贊開,胡春菊.橙皮苷的抑菌效果研究[J].西北農業學報,2004,13(2):87-89.

[8] 韓艷,王慶偉,張琰,等.丁香對幽門螺桿菌的體內抑菌作用[J].醫藥導報,2011,30(3):302-303.

[9] 胡定政,榮進剛.除幽湯治療Hp感染的臨床研究[J].時珍國醫國藥,1998,1(9):15.

[10] 劉建平,徐華洲,王瑞芳,等.胃喜康煎劑對幽門螺桿菌的抑菌實驗[J].中華實用中西醫雜志,2004,4(17): 2126.

[11] 傅南琳,黃守正,干磊,等.純陽正氣膠囊治療急性胃腸炎的臨床觀察[J].中國臨床藥理學與治療學,2001,6 (2):145-148.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.013

Inhibition Effect of Chunyang Zhengqi Capsule Against Helicobacter Pylori in vitro

FENG Qing1,2,LIU Wei2,3,SU Nan2,4,WU Xin-rong2
(1.School of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Department of Pharmacy,General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guangzhou 510010,China;3.School of Pharmaceutical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;4.School of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Objective To evaluate the antibacterial effect of herbal compoundchunyang zhengqicapsules againstHelicabacter pylori in vitro.MethodsThe inhibition zone andAvalue were measured by the agar disk method and trace multiple proportion dilution for evaluating the bacteriostasis ofchunyang zhengqicapsules.ResultsIt was showed thatHelicabacter pyloriwas moderately sensitive tochunyang zhengqisolution at concentrations above 0.05 g·mL-1.By measuring theAvalue of the bacteria solution,the bacterialstasis ofchunyang zhengqicapsule at 0.4,0.2,0.1 g·mL-1was 76.01%,69.83%,48.52%,respectively,which was significantly different from the negative control(P＜0.05).ConclusionThe herbal compoundchunyang zhengqicapsule has a certain inhibitory effect against H.pylori.

Chunyang zhengqicapsule;Helicobacter pylori;Bacteriostasis,in vitro

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0322-03

2013-05-15

2013-06-20

馮青(1989-),女,河北邯鄲人,在讀碩士,研究方向:藥物篩選及機制研究。電話:020-88654670,E-mail：fqyouxue@163.com。

吳新榮,女,主任藥師,博士生導師。電話: 020-88653476,E-mail：gzwxrong@yahoo.com。