pH敏感脂質體在藥物傳遞系統中的應用

曾慧琳，王姍姍，符旭東

(1.廣州軍區武漢總醫院藥劑科，武漢 430070;2.湖北中醫藥大學藥學院2012級研究生班，武漢 430065)

·藥學進展·

pH敏感脂質體在藥物傳遞系統中的應用

曾慧琳1，2，王姍姍1，2，符旭東1

(1.廣州軍區武漢總醫院藥劑科，武漢 430070;2.湖北中醫藥大學藥學院2012級研究生班，武漢 430065)

近年來,pH敏感脂質體研究取得顯著進展。該文從pH敏感脂質體結構、特點、釋藥原理、構建以及作為載體的應用等方面進行綜述,以期為pH敏感脂質體的應用和研究等提供參考。

pH敏感脂質體；載體；釋藥原理

近年來,隨著對脂質體關注的增加,對其進行表面修飾,產生了pH敏感脂質體,這不僅彌補了常規脂質體的缺點,提高了脂質體的靶向性,還促進藥效的充分發揮并提高基因的表達水平,在藥物傳遞系統中具有良好的應用價值。本文對pH敏感脂質體的結構、特點、釋藥原理、構建以及其作為載體的應用等方面展開簡要論述。

1 pH敏感脂質體的結構、特點以及釋藥原理

pH敏感脂質體(pH-sensitive liposomes)是一種對pH敏感的脂質體,其結構中的脂質雙分子層的穩定性隨環境pH變化而變化,同時也可稱其為酸敏脂質體。在腫瘤間質液、局部缺血區域以及被感染或有炎癥的區域,其pH比周圍正常組織明顯偏低,出現異常酸化現象,基于病變組織生理環境pH改變,研究者開發了pH敏感脂質體[1]。

目前研究的pH敏感脂質體主要集中于兩大系統,第一大系統是采用pH敏感性類脂組成,第二大系統則是采用pH敏感性的聚電解質結合在脂質體的表面而形成[2]。pH敏感脂質體在pH=7.4中性環境時結構穩定,而在pH較低的酸性環境下,可使脂肪酸羧基質子化,進而引起六方晶相(H11相)的形成,促使其膜相互融合來釋放藥物[1,3]。在細胞內酸性條件下,即pH由中性降到酸性的時候,pH敏感脂質體膜的結構變成疏松的六方晶相,脂質體和溶酶體膜/核內體膜相互快速融合,將膜吸附、膜嵌入或者包封的物質輸送到主動靶向的病變組織[3](圖1)。由此可見,pH敏感脂質體不僅能夠一定程度上減少溶酶體中的酶對藥物的降解,還能使內容物的穩定性和攝取量提高,將藥物有效地轉運到胞質及病變組織中[4]。

圖1 第一類pH敏感脂質體的釋藥原理A.在pH降低成酸性時,即H+增加時,脂質雙分子層轉變為六方晶相(H11相)。B.pH敏感脂質體變為六方晶相(H11相)后不穩定,脂質體膜和內體膜相互融合被促進,將內容的藥物輸送到病變組織(圖片來源:Advanced Drug Delivery Reviews,2010,62(4): 576-588.)

而第二類pH敏感脂質體即具有聚電解質如聚乙基丙烯醇(poly ethyl ellyl alcohol,PEAA)等的脂質體,當pH發生變化時,這種連接于雙分子層上的聚電解質鏈的構象也將發生變化,從而引發脂質雙分子層結構重排,繼而將內容物快速并定量地釋放出來[5](圖2)。

圖2 第二類pH敏感脂質體的釋藥原理(在酸性環境下,雙分子層上聚電解質鏈構象發生改變,脂質體穩定性受到破壞,其內容物被釋放出來,圖片來源:藥學學報, 2009,44(5):519-524.)

2 pH敏感脂質體的構建

2.1 pH敏感性化合物與腦磷脂組成的pH敏感脂質體 早期pH敏感脂質體的研究主要通過選擇不同磷脂來實現脂質體pH敏感性。這種pH敏感脂質體主要由pH敏感性化合物以及不飽和腦磷脂(unsaturated phosphatidylethanolamine,PE)組成的。其中常用于制備的不飽和腦磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine,DOPE)[6]。而pH敏感脂質化合物的親水部分含有pH敏感性基團,這些基團多含有羧基,如油酸(oleicacid,OA)、膽固醇半琥珀酸酯(cholesteryl hemisuccinate,CHEMS)和棕櫚酰同型半胱氨酸(N-Palmitoyl homocysteine,PHC)等[7]。不飽和腦磷脂為圓錐形,頭小身大(即親水端小親油端大),而pH敏感脂質化合物的羧酸基在中性條件下,為倒圓錐形,頭大身小(即親水端大親油端小),于是兩者互補形成了脂質體雙層膜并穩定的在于中性環境。當pH降低為酸性時,羧酸基將會發生質子化,親水端體積將會相對減小,于是在立體構象上不能與不飽和腦磷脂互補,從而導致脂質體不穩定[8]。各種不同的pH敏感的脂質體可以通過調節脂質的組成比例或者改變膜材種類而獲得[9]。

CHO等[10]采用不飽和腦磷脂和pH敏感性化合物制備表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向pH敏感長循環免疫脂質體,用熒光鈣黃綠素從脂質體的泄漏率評價pH敏感性,當DOPE/CHEMS為6∶4時,所得脂質體在pH=5.5時顯示出較強的酸敏性,將吉西他濱封裝于所得pH敏感脂質體中,其抑制癌細胞增殖的作用為游離藥物的2倍。采用pH敏感性化合物和腦磷脂制備的脂質體實現了制備pH敏感脂質體的初步設想,也是現在最常見的用于構建pH敏感脂質體的方法。

2.2 pH敏感性蛋白與多肽修飾的脂質體 將融合肽或者融合蛋白插入磷脂雙層是pH敏感脂質體的另一種制備方法。病毒膜上有一種特殊的蛋白使其能以融合的方式進入靶細胞,這種蛋白在pH酸性環境下結構發生改變活化。基于病毒蛋白的原理,用pH敏感性蛋白與多肽修飾脂質體,pH=7.4時,此類pH敏感性蛋白或者多肽將不會活化,在pH降低為酸性時,此時的pH敏感性蛋白或者多肽的結構將會隨之發生改變,促進脂質體膜和細胞膜的相互融合,使此方法構建的pH敏感脂質體中的內容物被釋放。

SOSUNOV等[11]將pH(低)插入肽[pH(low)insertion peptide,pHLIP]來修飾脂質體,以心肌缺血小鼠為模型(缺血區域的pH降低),經實驗對比得知,pHLIP酸敏感脂質體在心肌缺血危險區域的平均熒光強度比正常心肌高,由此說明pHLIP酸敏感脂質體能靶向作用于心肌缺血區域,為今后治療心肌缺血開辟了新途徑。采用pH敏感性蛋白和多肽修飾的脂質體保留了蛋白的pH敏感融合的特點,擴展了pH敏感脂質體的設計和制備方法,但pH敏感多肽和蛋白在修飾了脂質體后仍會存在免疫活性,所以如何克服這一問題成為今后研究的重點。

2.3 pH敏感性高分子材料修飾的脂質體 pH敏感性高分材料子可以用來構建pH敏感脂質體,主要分為含有氨基和含有羧酸基的高分子材料兩類。常通過將pH敏感性高分子材料修飾在脂質體外表面或者鑲嵌在脂質體雙層膜內而得到pH敏感脂質體,這類材料制得的脂質體其融合性能和pH敏感性都較高。具有氨基高分子材料如聚組氨酸和聚賴氨酸,需要與負電荷脂質體的相融合才能構建pH敏感脂質體。將羧酸基和親油基團引入聚乙二醇高分子修飾在脂質體外表面也可制成pH敏感脂質體。

有學者通過高分子插入方法,采用被脂肪酰胺修飾的聚2-乙基丙烯酸pH敏感性高分子材料修飾而得到了pH敏感脂質體,并對制成的pH敏感脂質體的釋藥性能進行實驗[12]。結果,當pH為中性時較穩定,當pH=5時80%熒光鈣黃綠素從脂質體中釋放,由此證明此方法所構建的pH敏感脂質體的pH敏感性較靈敏且具有較高的融合性。采用pH敏感高分子材料修飾的脂質體制備方法可控性較好,釋藥性能良好且簡便,將成為pH敏感脂質體研究中的重點。

3 pH敏感脂質體作為載體的主要應用

3.1 pH敏感脂質體作為抗腫瘤藥物的載體 當腫瘤組織局部缺血時,腫瘤間質液區域內的pH為5.0～6.5,低于正常組織,呈現酸化,pH敏感脂質體作為載體可以將藥物釋放到靶向部位。

為減少順鉑(cisplatin,CDDP)的毒副作用,提高藥物生物利用度和靶向性,LEITE等[13]研究開發了長循環和pH敏感脂質體順鉑(long-circulating and pH-senstive liposomes containing cisplatin,SPHL-CDDP)。其中脂質體是由DOPE、CHEMS和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(distearoryl phosphatidyl ethanolamine-polyethy leneglycol 2000,DSPE-PEG2000)組成,在pH為酸性的部位,如腫瘤部位,CHEMS質子化,脂質體釋放出藥物。采用瑞士雌小鼠,用艾氏腹水瘤細胞通過腹膜內途徑接種造模,經實驗研究,SPHL-CDDP通過靜脈給藥,與普通CDDP給藥相比,小鼠腫瘤生產抑制率增加,同時能顯著降低腎毒性,長循環pH敏感脂質體作為抗腫瘤藥物的載體,可以更好地改善CDDP療效并減少毒副作用。

3.2 pH敏感脂質體作為基因的載體 相對病毒載體,pH敏感脂質體有低免疫原性、低細胞毒性、容易制備而且能容納較大的目的基因,體現出其作為基因載體的優勢[14]。

將基因包封于普通的脂質體中,在溶酶體中其基因片段容易被酶降解,不能發揮生物學效應。而pH敏感脂質體可以克服傳統脂質體的這一缺點,能夠避免基因片段被降解,增加包封物穩定性,將其轉運至細胞質。由于正負電荷相吸的原理,常用陽離子脂質體作為基因載體,但陽離子脂質體在體循環過程中不穩定,容易引起較大細胞毒性。而pH敏感脂質體由于表面帶負電荷,將不會和血液中糖蛋白及聚陰離子一些等帶有負電的離子相互作用,相對于陽離子脂質體而言具有較低的細胞毒性和較高的穩定性。

SHI等[15]研究了葉酸受體(folate receptor,FR)靶向的pH敏感脂質體和陽離子脂質體的復合物在細胞內基因的表達,將葉酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺連接于制備好的抗血清pH敏感脂質體上。結果顯示,FR靶向的pH敏感脂質體包裹的阿糖胞苷,相對非pH敏感脂質體而言增加胞漿殘留的鈣黃綠素的釋放,使KB細胞的半數抑制濃度下降,是高效的基因傳遞載體。

王弘等[16]針對作為基因載體的pH敏感脂質體的制備方法及處方篩選方面做了研究,目的是探尋高基因轉染率的酸敏脂質體的制備方法及最優處方,實驗以組成比、pH及制備工藝為3個因素,以基因轉染熒光測定值作為指標,運用正交設計法得到DC-膽固醇和大豆磷脂(soyabean lecithin)為4∶6的組成比,pH為5.4時并用減壓蒸發-超聲波分散法制得的pH敏感脂質體的測定值最高。

3.3 pH敏感脂質體作為寡核苷酸的載體 目前有學者利用陰離子pH敏感的融合脂質體對反義寡核苷酸進行包裹,進而通過內吞進行遞送,在pH低的酸性環境下結構不穩定,引發脂質體膜和內體膜相融合,將內容物寡核苷酸(ologonucleo-tides,ODNs)釋放到細胞質,避免被核酸酶降解,從而發揮其生物活性[17]。有學者通過實驗研究發現,游離型ODNs使細胞攝取的量相對于pH敏感脂質體作為抗-myb寡核苷酸載體而言低3～5倍,這是由于pH敏感免疫脂質體作為載體能增加ODNs在人淋巴白細胞及骨髓內的轉運[18]。

LUBRICH等[19]做了關于pH敏感脂質體作為反義寡核苷酸的載體來抑制星形膠質細胞中肌醇的攝取方面的研究,結果封裝成反義寡核苷酸pH敏感脂質體與游離的反義寡核苷酸相比明顯增加抑制肌醇的攝取,且達到50倍,因此應用鈉肌醇協同轉運蛋白(sodium/myo-inositol cotransporter,SMIT)在pH敏感脂質體包裹反義寡核苷酸來阻斷SMIT活動比游離的反義寡核苷酸更有效。由此可見,pH敏感脂質體作為寡核苷酸類的載體,能夠在實驗中明顯地發揮其生物活性。

3.4 其他 MORILLA等[20]就將pH敏感脂質體作為抗寄生蟲藥物依他硝唑(etanidazole,ETZ)的載體,其中載藥的pH敏感脂質體用膽甾醇半琥珀酸酯與二油酰磷脂酰乙醇胺以摩爾比4∶6制備。后以小鼠為模型對其抗克魯斯錐蟲的活性做了實驗研究。結果發現,用ETZ pH敏感脂質體(ETZ loaded in pH-sensitive liposones,L-ETZ)能顯著減少受感染小鼠的寄生蟲血癥水平,相對游離的ETZ抗寄生蟲效果較好,在治療抗寄生蟲血病方面療效顯著。采用pH敏感脂質體作為載體能選擇性地傳遞ETZ至吞噬細胞的細胞質中,由此實驗研究可知,對于活性較差的藥物可利用此方法來提高藥物的療效。

4 結束語

pH敏感脂質體是作為“智能型脂質體”,利用病灶處pH的變化,將脂質體的被動靶向性和細胞內pH的變化相結合,在中性pH條件下很穩定,當pH降低為酸性時,脂質體破裂或者融合來釋放出其內容的藥物,實現利用pH的變化而有針對性地釋放內容物使藥物到達靶向部位。隨著近年來生物技術的不斷發展,基因、核酸、多肽、蛋白質等大分子越來越多地被運用于疾病的治療中,而pH敏感脂質體作為其良好的載體無疑將成為藥物制劑研究領域的重點。然而,pH敏感脂質體的研究開發等方面還有很多待解決的問題,如靶向性、包封率和穩定性等。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.022

R94

A

1004-0781(2014)03-0348-04

2013-02-19

2013-03-20

曾慧琳(1990-),女,湖北武漢人,在讀碩士,從事藥物新劑型新技術研究。E-mail：baobao740240709@163.com。

符旭東(1969-),女,湖南沅陵人,碩士生導師,主任藥師,從事藥物新劑型新技術研究。E-mail：fuxudong2005@yahoo.com.cn。