Box-Behnken響應面法優化他克莫司傳遞體制備工藝*

雷偉，余楚欽，林華慶，周小圓

(廣東藥學院，廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州 510006)

·藥物制劑與藥品質量控制·

Box-Behnken響應面法優化他克莫司傳遞體制備工藝*

雷偉，余楚欽，林華慶，周小圓

(廣東藥學院，廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州 510006)

目的 確定他克莫司傳遞體的最優處方工藝。方法以包封率、粒徑作為響應值,采用Box-Behnken響應面法優化處方,并評價其理化性質。結果最優處方工藝是藥脂比為0.06,聚山梨酯80∶蛋黃卵磷脂為0.31,超聲時間9.5 min,制備的傳遞體包封率為85.930%,粒徑為101.8 nm,具備一定的體外形變能力和穩定性。結論Box-Behnken響應面法能準確地優化他克莫司傳遞體的處方工藝。

他克莫司；傳遞體；Box-Behnken響應面法；制備工藝

他克莫司(tacrolimus,FK506)軟膏(商品名:普特彼?)于2002年被批準用于治療中到重度特應性皮炎[1]。但由于FK506的強親脂性(油水分配系數logP=3.96±0.83)、大分子量(相對分子質量822.05)及其環狀分子結構,軟膏中的藥物主要潴留在皮膚角質層中,無法到達深層皮膚組織發揮藥效[2]。傳遞體(transfersomes)由德國學者GREGOR等[3]首次提出,它是將表面活性劑(如聚山梨酯80、膽酸鈉等)加入普通脂質體材料中制成具有很強的自身形變能力,可穿透比它本身小數倍的皮膚孔道的類脂質體。筆者在本實驗中將FK506包裹于傳遞體中,采用Box-Behnken響應面法以較少的實驗次數和較短的時間[4]對他克莫司傳遞體的處方工藝參數進行全面有效的優化,同時考察其體外變形能力及穩定性,為以后他克莫司傳遞體經皮滲透研究打下基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dinonex公司),超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司),JEM-1400透射電鏡(日本JEOL電子公司),DelsaTMNano C粒徑儀(美國Beckman Coulter有限公司),LSP01-1A單推注射泵(蘭格注射泵有限公司)。

1.2 試藥 他克莫司對照品(上海同田生物技術股份有限公司,純度:99.4%,批號:12033031),他克莫司原料藥(華東醫藥有限公司,純度:98.0%,批號:091001),蛋黃卵磷脂(Lipoid E80,PC,上海東尚生物科技有限公司提供,批號:F20100021),其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 他克莫司傳遞體的制備 采用薄膜蒸發-探頭式超聲分散法制備。稱取處方量蛋黃卵磷脂、聚山梨酯80(分析純)、他克莫司置于圓底燒瓶,無水乙醇溶解完全,35℃水浴旋轉揮干乙醇使成均一類脂薄膜。然后往圓底燒瓶中加入pH6.5 PBS水合介質20 mL,旋轉洗膜1 h,冰水浴下探頭式超聲處理(超聲2 s,停2s),孔徑0.20 μm微孔濾膜過濾,即得到帶淡藍色乳光的傳遞體混懸液。

2.2 傳遞體的含量和包封率測定

2.2.1 含量測定方法 色譜柱:Agilent公司ZORBAX SB-C8(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.1%磷酸∶乙腈(40∶60);柱溫:60℃;檢測波長:210 nm;流速:1.0 mL·min-1;進樣量:20 μL。

取他克莫司對照品20 mg精密稱定,置20 mL量瓶,配成貯備液,吸取貯備液1 mL,用流動相稀釋至10 mL,得100 μg·mL-1對照品溶液,調節進樣體積分別為1,2,5,10,40,80 μL,以峰面積(A)對質量濃度(C)作線性回歸,得回歸方程為A=0.285 1C-0.516 7,r=0.999 8,在5～400 μg·mL-1濃度范圍內具有良好的線性關系。精密吸取空白傳遞體1.0 mL置于10 mL量瓶,依次加入貯備液0.8,1.0,1.2 mL,甲醇破乳,每個濃度平行配置3份,測得80,100, 120 μg·mL-1回收率,結果均在95%～105%范圍內, RSD均＜2%。取他克莫司傳遞體混懸液1 mL置于10 mL量瓶,甲醇破乳,得供試品溶液,供試品溶液在12 h內穩定,日內精密度實驗RSD值＜2%(n=6), HPLC測定方法準確可靠。

2.3 Box-Behnken響應面法優化處方工藝

2.3.1 優化實驗設計 采用Box-Behnken響應面法優化他克莫司傳遞體制備的處方工藝。采用Design-Expert?設計軟件,以包封率(Y1,%)、粒徑(Y2,nm)為優化指標,根據預實驗及最高或最低條件下制備傳遞體的可行性,選取藥脂比(藥物∶PC,X1,質量比)、聚山梨酯80∶PC(X2,質量比)、超聲時間(X3,min)作為考察對象,3個設計水平代碼分別為0,+1,-1,設計3因素、3水平、17個實驗點的響應面優化實驗,響應面因素水平見表1。

表1 響應面因素水平表Tab.1 Factors and levels of response surface method

2.3.2 回歸模型擬合及預測 對包封率(Y1)、粒徑(Y2)進行回歸分析,建立多元二次回歸模型:Y=b0+ b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b13X1X3+b23X2X3+其中,Y為響應值;b0為常數項, b1、b2、b3為線性系數,b12、b13、b23為相互項系數,b11、b22、b33為平方項系數。

根據回歸模型,繪制三維效應面圖,從每一個效應面均可以得到一個較優的實驗條件范圍,幾個較優的實驗條件進一步重疊,即可獲得最優條件。

2.3.3 結果驗證 根據優化設計獲得的最優條件制備3批樣品,將指標的實驗值與預測值進行比較,計算偏差。17次實驗設計表及響應值見表2。

2.4 形態觀察 將優化得到的傳遞體混懸液用PBS稀釋10倍,滴到銅網上,放置約1 min以便使傳遞體吸附,用濾紙吸去多余液體,用2%磷鎢酸溶液負染1 min,濾紙吸去多余染色液,干燥后用透射電子顯微鏡觀察傳遞體形態。

2.5 粒徑分布測定 粒徑測定使用Beckerman粒徑儀。傳遞體混懸液用PBS稀釋1倍,測定溫度為25℃。

3 結果

3.1 優化實驗結果及模型擬合 Box-Behnken響應面法實驗設計方案及結果見表2,用Design-Expert 8.0.4版軟件對結果進行分析,以包封率和粒徑兩個評價指標分別對3個因素進行多元二項式方程擬合,二項式方程分別為:

表2 Box-Behnken響應面法設計方案及結果Tab.2 Designs and results of Box-Behnken response surface method

3.2 效應面優化及預測 根據擬合方程繪制描述各因素與指標之間關系的效應曲面,結果見圖1。從效應面的最高點可以看出所選范圍存在極值,可以直觀地判斷各因素的最優范圍。他克莫司為親脂性藥物,主要分布于脂質體膜的雙分子層結構中,固定超聲8 min,隨著藥脂比逐漸增大,包封率相應增大,藥物在傳遞體中的分布逐漸達到飽和狀態,繼續增加藥物,超出磷脂的承載能力,使傳遞體的雙層結構破壞,傳遞體容易發成融合,包封率降低,粒徑增大,優化的藥脂比范圍為0.03～0.08。聚山梨酯80作為表面活性劑,主要嵌插于傳遞體膜中,增強膜的流動性,使得膜彈性形變增大。一定濃度的聚山梨酯80可增加他克莫司在傳遞體混懸液中的溶解度,且使傳遞體具有較大的形變能力,易于破裂成小粒子,但隨著表面活性劑濃度進一步增加,易形成混合膠團,降低對藥物的包載能力,同時整個體系的粒徑變大[8],聚山梨酯80∶PC值在0.25～0.40范圍較適宜。粒徑受超聲時間長短影響最明顯,超聲時間越長,粒徑越小,但同時也會引起傳遞體中藥物的泄漏,導致包封率的降低,超聲時間控制在8～11 min內,可得到適宜的粒徑范圍90～130 nm。

表3 二項式方程模型的顯著性分析Tab.3 Significance analysis of binomial equation model

圖1 各自變量與包封率、粒徑的效應面圖Fig.1 Response surfaces of entrapment efficiency and particle diameter with independent variables

使用Design-Expert 8.0.4版軟件根據響應面曲線預測出他克莫司傳遞體的最優處方:X1=0.06、X2= 0.31、X3=9.5,即PC 0.800 g、他克莫司48 mg、聚山梨酯80 0.248 g、PBS 20 mL,超聲處理9.5 min。按此處方分別制備3批傳遞體,其實驗平均值與預測值的比較見表4,平均包封率85.930%,平均粒徑101.8 nm,相對偏差均＜5%,各實驗值與預測值吻合良好,證明了用效應面法獲得的優化區域比較準確。其中,偏差(%)=(實驗值-預測值)/預測值×100%。

表4 優化實驗結果驗證Tab.4 Verification of response surface methodology n=3

3.3 傳遞體粒徑及電鏡觀察結果 優化實驗得到的傳遞體混懸液略帶淡藍色,粒徑分布范圍窄,呈正態分布,平均粒徑101.8 nm,多分散性指數為0.299(圖1)。透射電鏡下呈橢圓形,有指紋狀螺旋,具有明顯的脂膜包裹形態(圖2)。

圖2 他克莫司傳遞體的粒徑分布圖Fig.2 Size distribution of tacrolimus transfersomes

3.4 變形性 在0.2 MPa外力作用下,普通脂質體、傳遞體、水通過濾膜的時間分別為306,184和120 s,即P脂質體=2.550,P傳遞體=1.533,這說明,相比于普通脂質體,傳遞體中表面活性劑聚山梨酯80的存在可促進脂質體結構的變形,使之更易通過濾膜,為后期將傳遞體用作透皮轉運載體,將大分子藥物送入深層皮膚組織提供了體外實驗依據。

圖3 他克莫司傳遞體的透射電鏡照片(×30 000)Fig.3 TEM photograph of tacrolimus transfersomes at amplification of 30 000 times

3.5 加速穩定性 加速穩定性實驗中,A0=0.486,A1=0.455,得Ke=0.0637,離心前后吸光度值變化很小,說明傳遞體混懸液具有一定的穩定性。

4 討論

常用的包封率測定方法有葡聚糖凝膠柱層析法[9]、離心法[10]、透析法,這三種方法本實驗中均有嘗試。由于他克莫司難溶于水,用水洗脫時容易析出結晶,在凝膠柱中保留時間短,導致載藥傳遞體與游離藥物很難完全分離,該法不適宜用于他克莫司傳遞體包封率的測定。同時,采用超速冷凍離心法,4℃離心, (35 000 r·min-1,3 h),游離藥物與載藥傳遞體完全分離,包封率測定結果與透析法接近,但由于本實驗室不具備超速冷凍離心機,綜合考慮,最終選用透析法測定他克莫司傳遞體的包封率。

筆者在前期處方篩選實驗中發現,不同的表面活性劑對傳遞體的影響不一。其中,包封率:聚山梨酯-80＞膽酸鈉＞司盤-80,粒徑:聚山梨酯-80≈膽酸鈉＞司盤-80。用司盤-80作為表面活性劑,傳遞體混懸液分層明顯,超聲分散后粒徑仍然很大。ELMAGHRABY等[11]實驗發現,不同表面活性劑的親水親油平衡值(HLB值)不同,在脂質相與水相的親和分布能力也不一樣,因而其與類脂質膜相互作用能力大小也有差異。司盤-80(HLB=4.3)親脂性最強,與藥物競爭性插于類脂質膜中,擾亂了脂質雙分子層結構,容易造成類脂結構的破壞和藥物的泄漏。不同表面活性種類是否會對傳遞體透皮性能產生影響,還需進一步考察研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.024

Optimized Preparation of Tacrolimus Transfersomes by Box-Behnken Response Surface Method

LEI Wei,YU Chu-qin,LIN Hua-qing,ZHOU Xiao-yuan
(Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery,Guangzhou 510006,China)

Objective To determine the optimal process for the preparation of tacrolimus transfersomes.MethodsThe preparation of tacrolimus transfersomes was optimized via the Box-Behnken response surface method with entrapment efficiency and diameters as responding indicators,and their physicochemical properties were evaluated.ResultsThe optimized technical parameters were as follows:drug-lipid as 0.06;polysorbate80-PC as 0.31;ultrasonic for 9.5 min.The encapsulation efficiency and diameters of the optimized tacrolimus transfersomes were 85.930%and 101.8 nm,respectively.Tacrolimus transfersomes had a certain deformation ability and stability.ConclusionBox-Behnken response surface method could accurately optimize the preparation of tacrolimus transfersomes.

Tacrolimus;Transfersomes;Box-Behnken response surface method;Optimized preparation

R979.5;TQ460.1

A

1004-0781(2014)03-0355-06

2013-02-19

2013-03-20

*藥物制劑關鍵技術研發及產業化示范(2008A1-E4101)

雷偉(1989-),女,湖北荊州人,在讀碩士,主要研究方向:藥物新劑型與新技術。電話:020-39352518,E-mail：leiwei-1234@163.com。

林華慶,男,教授,碩士生導師,主要從事藥物新劑型與新技術研究及產業化開發。電話:020-39352518,E-mail：huaqing_@163.com。