正交實驗設計優化血脈疏通口服液水提工藝

易生富，陳兵，孫亞楠

(1.湖北中醫藥高等專科學校，荊州 434020;2.湖北省荊州市中醫院藥劑科，荊州 434010)

正交實驗設計優化血脈疏通口服液水提工藝

易生富1，陳兵2，孫亞楠1

(1.湖北中醫藥高等專科學校，荊州 434020;2.湖北省荊州市中醫院藥劑科，荊州 434010)

目的 優化血脈疏通口服液水提工藝。方法以加水量、煎煮時間、煎煮次數為考察因素進行正交實驗,采用3因素3水平正交設計,以黃芪甲苷、總多糖及80%醇浸出物量作為指標值。結果煎煮次數和加水量對黃芪甲苷、總多糖及80%醇浸出物量具顯著影響,優選煎煮提取工藝為煎煮3次,加12倍量水,煎煮0.5 h。結論該實驗確定了血脈疏通口服液的最佳提取工藝。

血脈疏通口服液；正交實驗；水提工藝；黃芪甲苷

血脈疏通口服液為湖北省荊州市中醫院自制中藥制劑(自制制劑批準文號:鄂藥制字Z20110885),由赤芍、黃芪、牛膝、防風、桃仁、地龍、葛根、石菖蒲等組成,具益氣、活血、通脈的作用,用于治療因氣虛血瘀所致的冠心病、心絞痛及脂肪肝有很好療效,治療冠心病、心絞痛患者70例,總有效率93.33%;治療脂肪肝患者176例,總有效率89.16%[1-2]。方中牛膝、黃芪、赤芍、葛根、桃仁等藥含皂苷類、黃酮類和多糖類,考慮水煎煮法提取;石菖蒲、防風含揮發油,在提取揮發油后,再與赤芍、黃芪、牛膝、葛根、桃仁等藥合煎。為了保證制劑質量,筆者在本實驗中采用正交實驗設計法,優化血脈疏通口服液煎煮提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waterse-2695高效液相色譜儀,Empower工作站,Waters-2424蒸發光散射檢測器(美國沃特士公司);Ohaus-AR124CN型電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司);UV-3000型可見紫外分光光度計(日本島津);高速離心機(美國MICRO12-24)。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110683-200916),血脈疏通口服液(自制,批號:20120119,規格:每支10 mL),乙腈為色譜純,葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110976-200903),其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備 按處方比例,稱取石菖蒲6 g、防風8 g,按提油工藝提油,濾過得藥液和藥渣備用。按處方比例,稱取黃芪30 g、赤芍10 g、牛膝10 g、桃仁8 g、葛根10 g、地龍8 g與石菖蒲、防風提油后的藥渣混合,按規定的加水量、煎煮時間、煎煮次數提取、過濾、濃縮并定容至100 mL(每毫升含生藥0.9 g)。

2.2 單因素實驗 按“2.1”項樣品的制備方法,分別調整加水量8,10,12,14倍,煎煮時間0.5,1.0,1.5, 2.0 h,煎煮次數1,2,3,4次,進行單因素實驗。

2.2.1 加水量的影響 在煎煮時間為1 h,煎煮1次,加水量從8倍增加到12倍時,總多糖含量、黃芪甲苷含量、80%醇浸出物量增加較多。但當加水量增至14倍后,總多糖含量、黃芪甲苷含量近乎沒有變化,80%醇浸出物量增加緩慢。因此,加水量應選定為約12倍宜。

2.2.2 煎煮次數的影響 在加水量為12倍,煎煮時間1 h,隨著煎煮次數的增加,總多糖含量、黃芪甲苷含量、80%醇浸出物量相應增加。當煎煮次數增加到4次以后,總多糖含量、黃芪甲苷含量增加緩慢,80%醇浸出物量有增加但雜質增加較多。因此煎煮次數選為3次宜。

2.2.3 煎煮時間的影響 在加水量為12倍,煎煮3次的條件下,隨著煎煮時間的延長,總多糖含量、黃芪甲苷含量、80%醇浸出物量增加緩慢,考慮到節約工時,煎煮時間選為0.5 h。

2.3 正交實驗設計 選取煎煮時間、加水量、煎煮次數3個因素,各取3個水平進行L9(34)正交實驗。黃芪是方中君藥,黃芪甲苷是其主要有效成分,以黃芪甲苷含量評價指標,權重系數定為0.5;黃芪中多糖為有效成分,方中牛膝、葛根、防風也含有多糖,因此總多糖含量作為另一個評價指標,權重系數定為0.3;80%醇浸出物為大類成分作為間接控制的指標,權重系數定為0.2,以此篩選最佳提取工藝[3]。綜合評分=0.5×黃芪甲苷含量+0.3×總多糖含量+0.2×80%醇浸出物量。正交實驗表見表1,2。

2.4 黃芪甲苷的含量測定

2.4.1 分析方法的選擇 黃芪甲苷含量測定方法文獻報道有高效毛細管電泳法、薄層掃描法、高效液相色譜-蒸發光散射檢測法、半高效液相色譜-質譜串聯法等[4-7]。本實驗采用HPLC-ELSD檢測法[8]。

表1 正交實驗因素水平表

2.4.2 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(35∶65);檢測器:蒸發光散射檢測器200 s;柱溫35℃;漂移管溫度65℃;氣體流量:1 L·min-1;進樣量:10 μL;理論板數按黃芪甲苷峰計算應不低于3 000。

2.4.3 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的黃芪甲苷標準品2 mg于10 mL量瓶,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻即可得到0.2 mg·mL-1對照品溶液。

2.4.4 供試品溶液的制備 精密吸取各正交實驗樣品溶液10 mL,用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,用氨試液洗滌2次,每次20 mL,棄去氨液,正丁醇液水浴蒸干,殘渣加水5 mL使溶解,通過D101型大孔吸附樹脂(內徑1.5 cm,長12 cm),用水50 mL洗脫,棄去水液,再用40%乙醇30 mL洗脫,棄去40%乙醇洗脫液,繼用70%乙醇50 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,用甲醇溶解并轉移至2 mL量瓶,加甲醇至刻度,搖勻即得[9-10]。

2.4.5 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液1,2, 4,6和8 mL分別置于10 mL量瓶,分別加甲醇稀釋定容,搖勻,即得0.02,0.04,0.08,0.12和0.16 mg·mL-1對照液。取以上溶液各20 μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜峰。以峰面積(Y)與濃度(X,μg·mL-1)進行回歸,繪制標準曲線,得回歸方程:Y=58 102X+1 052.7,r=0.999 3(n=5)。結果表明,樣品在0.4～3.2 μg·mL-1濃度范圍內,濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.4.6 陰性干擾的判斷 照供試品溶液的制備方法制備缺黃芪的陰性對照品溶液,依照上述色譜條件進行測定,供試品溶液色譜圖中,在與對照品溶液色譜圖相應的位置上有相同的色譜峰,而陰性對照品溶液無相應的色譜峰。

2.4.7 精密度實驗 對已配制的1.6 μg·mL-1黃芪甲苷標準品溶液,在色譜條件下連續進樣5次,分別測定峰面積,計算RSD為0.58%(n=5)。

2.4.8 穩定性實驗 取供試品溶液,分別在0,2,4, 6,8,10,12 h測定進樣10 μL,記錄峰面積,計算RSD,結果RSD為0.47%(n=7),表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.4.9 重復性實驗 取1.6 μg·mL-1黃芪甲苷標準品溶液5份,在色譜條件下進樣測定峰面積,RSD為0.53%(n=5),重復性良好。

2.4.10 加樣回收率實驗 量取供試品溶液20 μL5份,各加入不同量的對照品溶液,按“2.4.5”項方法測定峰面積,計算回收率。結果見表3。平均加樣回收率98.8%,RSD=1.02%。

2.4.11 樣品含量測定 精密量取各供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀,在色譜條件下記錄色譜峰,將峰面積代入回歸方程中,得到溶液中黃芪甲苷的濃度,進一步計算得到黃芪甲苷的含量。結果見表2。

2.5 總多糖含量測定 總多糖含量測定方法文獻報道有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)等[11-13]。筆者在本實驗中采用苯酚-硫酸法。

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖標準品60 mg置于100 mL量瓶,加純化水溶解至刻度,即得0.6 mg·mL-1對照品溶液。

2.5.2 苯酚溶液的配制 精密稱取苯酚4.0 g于100 mL量瓶,加水溶解至刻度,即得4%苯酚溶液,移至棕色瓶中保存。

2.5.3 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0.0, 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0 mL分別轉移到50 mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻。精密量取上述各溶液2.0 mL置10 mL具塞試管,分別精密加入4%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速精密加入濃硫酸7.0 mL,搖勻,沸水保溫15 min,取出后迅速用冷水冷卻至室溫,以第一份為空白對照液,在400～600 nm波長范圍內掃描,得最大吸收波長為487 nm。在487 nm波長處,測定各對照品吸光度,以濃度(Y)為橫坐標、吸光度(X)為縱坐標繪制標準曲線,回歸方程為Y=0.022 6X+0.008 9,r= 0.999 6(n=5)。

2.5.4 樣品溶液的配制 精密吸取各樣品濃縮液,加無水乙醇4 mL,邊加邊振搖,使含醇量達80%, 2 000 r·min-1離心20 min,沉淀以水溶解,轉移到50 mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻。

2.5.5 精密度實驗 按“2.5.3”項方法重復測定同一濃度葡萄糖對照品溶液5次,計算測定結果RSD為0.61%。

2.5.6 穩定性實驗 取樣品溶液,按“2.5.3”項方法在室溫每隔30 min測定一次,連續3 h考察其穩定性,計算測定結果的RSD為1.21%。

表2 正交實驗結果表

2.5.7 樣品含量測定 精密吸取項樣品溶液2.0 mL,置10 mL具塞試管,分別精密加入4%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速精密加入濃硫酸7.0 mL,搖勻,沸水保溫15 min,取出后迅速用冷水冷卻至室溫。以純化水為空白,同法制得空白對照品液。在487 nm波長處測定吸光度,根據標準曲線回歸方程計算總多糖含量。結果見表2。

2.6 80%醇浸出物量測定 取各正交實驗號濃縮液10 mL,加無水乙醇40 mL,使乙醇濃度達到80%,靜置過夜,取上清液于干燥蒸發皿中,水浴蒸干,105℃烘箱干燥3～4 h至恒重,取出,迅速移至干燥器中放冷,取出精密稱重即得。結果見表2。

表3 黃芪甲苷加樣回收率實驗結果 mg,n=5

2.7 方差分析 對正交實驗結果作直觀分析和方差分析。方差分析見表4。

表4 方差分析表

由直觀分析可知,影響提取效果的因素順序為:煎煮次數＞加水量＞煎煮時間。經方差分析,煎煮時間對提取效果無顯著影響,為節約工時,定為B1,煎煮次數和加水量有顯著影響,以A3C3為宜。

2.8 驗證實驗 驗證3批。結果見表5。RSD值＜3%,表明所篩選的提取工藝條件基本穩定。

3 討論

方中黃芪為君藥,黃芪甲苷和多糖為黃芪的主要有效成分[14],現代藥理研究表明黃芪甲苷具有保護心臟和肝臟、抗細胞凋亡、免疫調節、改善血液流變學等作用[15],黃芪多糖具有增強免疫系統、保肝、降血糖、降血脂、抗氧化延緩衰老等藥理活性[16],故將黃芪甲苷含量作為評價工藝優劣的重要指標。方中臣藥牛膝,佐藥葛根、防風也含有多糖,因此將總多糖含量作為提取工藝的另一個評價指標,80%醇浸出物為大類成分,作為間接控制指標,以此篩選最佳提取工藝具有一定的科學性。

表5 驗證實驗結果 %,n=3

按正交實驗所篩選的最佳提取條件,本實驗還比較了石菖蒲、防風二藥提油后藥渣不再與黃芪、赤芍等藥合煎水提和二藥提油后藥渣與黃芪、赤芍等藥合煎水提兩種方法主要有效成分的影響。結果表明,分煎后出膏率降低近10%,黃芪甲苷含量無影響,總多糖含量近無影響,為降低出膏率,給后續除雜工藝降低難度,可以考慮將提取路線定為:石菖蒲、防風二藥提油后藥渣棄去,藥液與黃芪、赤芍等藥水提液合并。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.032

R286;TQ460.1

A

1004-0781(2014)03-0382-04

2013-07-05

2013-08-22

易生富(1966-),男,湖北荊州人,主任藥師,學士,主要研究方向:中藥制劑。電話:0716-8023540,E-mail：yishenfu@126.com。