分子排阻色譜法測(cè)定注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物

阮昊，鄭小玲，陳悅

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004)

分子排阻色譜法測(cè)定注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物

阮昊，鄭小玲，陳悅

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004)

目的 建立測(cè)定注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物的方法。方法采用Sephadex G-10凝膠色譜柱,以pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液[0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液∶0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]為流動(dòng)相A,以水為流動(dòng)相B,流速1.5 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。結(jié)果磺芐西林高分子聚合物與磺芐西林能較好分離,磺芐西林對(duì)照品在進(jìn)樣量為含磺芐西林0.59～47.46 μg范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(r=0.999 9);供試品溶液在20.68～40.48 mg·mL-1范圍內(nèi),溶液濃度與聚合物峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 4);重復(fù)性較好(RSD=4.3%,n=5);重現(xiàn)性較好(RSD=4.8%,n=3)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便,結(jié)果可靠,可以用于注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物的檢測(cè)。

磺芐西林鈉；高分子聚合物；分子排阻色潽

磺芐西林屬?gòu)V譜半合成青霉素類抗生素,主要適用于對(duì)本品敏感的銅綠假單胞菌、變形桿菌屬以及其他敏感革蘭陰性菌所致的肺炎、尿路感染、復(fù)雜性皮膚軟組織感染和敗血癥等[1]。

磺芐西林鈉致變態(tài)反應(yīng)常見(jiàn)。多年來(lái)的研究已證明,在β-內(nèi)酰胺類抗生素所致的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中,藥物分子本身只是半抗原,藥物中存在的高分子聚合物才引發(fā)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[2],因此嚴(yán)格控制抗生素中高分子聚合物的含量有著重要的意義。《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版采用Sephadex G-10凝膠色譜柱柱床體積變小,減少了分析時(shí)間(45～60 min)[3]。在水中,磺芐西林鈉由于分子間的氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用等可以形成締合物[4],與高分子聚合物具有相似的色譜行為,因此可以采用藥物自身為對(duì)照品,按外標(biāo)法計(jì)算。筆者在文獻(xiàn)[5-6]的基礎(chǔ)上,優(yōu)化并建立了測(cè)定注射用磺芐西林鈉中的聚合物的方法,縮短了分析時(shí)間,為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了參考。

1 儀器與試藥

上海金達(dá)生化儀器有限公司KFG-1抗生素高聚物分析系統(tǒng)(紫外檢測(cè)器),色譜柱為葡聚糖凝膠G-10 (40～120 μm)填充柱(內(nèi)徑1.0 cm,柱高40 cm)?；瞧S西林鈉對(duì)照品(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,批號(hào): 20040601,含量:82.4%);注射用磺芐西林鈉(蘇州二葉制藥有限公司,批號(hào):080501;瑞陽(yáng)制藥有限公司,批號(hào):08122212);葡聚糖凝膠Sephadex G-10為進(jìn)口分裝(Amersham Biosciences);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、藍(lán)色葡聚糖2 000(GE Pharmacia)均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用葡聚糖凝膠G-10(40～120 μm)為填充劑,玻璃柱(1.0 cm×40 cm),以pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液[0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液∶0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]為流動(dòng)相A,以水為流動(dòng)相B,流速1.5 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。量取0.2 mg·mL-1藍(lán)色葡聚糖2 000溶液100 μL,注入液相色譜儀,分別以流動(dòng)相A、B進(jìn)行測(cè)定,理論板數(shù)按藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算,在流動(dòng)相A與B中理論板數(shù)及拖尾因子均符合要求,理論板數(shù)為872,919,均大于700,拖尾因子為1.44,1.16,均＜2.0。

2.2 分離度實(shí)驗(yàn) 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版[3]附錄ⅤH分子排阻色譜法規(guī)定,檢查高分子聚合物時(shí),某些藥物分子單體與其聚合體不能達(dá)到基線分離時(shí),其分離度計(jì)算公式為:R=高聚體的峰高/單體與高聚體之間的谷高。

分離度實(shí)驗(yàn)溶液:由于高分子聚合物的對(duì)照品不易獲得,而樣品中的高聚物又極少,在配制分離度溶液時(shí),適當(dāng)加入藍(lán)色葡聚糖2 000,使聚合物峰增大。藍(lán)色葡聚糖2 000系在葡萄糖T2 000(平均相對(duì)分子質(zhì)量2 000 000)上引入多環(huán)生色團(tuán)冷凍干燥而成。在凝膠過(guò)濾法中,用于各種類型葡萄糖的床空隙容積的測(cè)定和校核柱的填充。一般藍(lán)色葡聚糖2 000的加入量是使聚合物峰面積達(dá)到規(guī)定限度的1～2倍。

稱取磺芐西林鈉約300 mg,置10 mL量瓶,用0.2 mg·mL-1藍(lán)色葡聚糖溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,進(jìn)樣100 μL,用流動(dòng)相A進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖進(jìn)行分析,得高聚物峰的含量為0.80%(擬規(guī)定限度為0.5%),分離度為2(圖1)。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液 取磺芐西林鈉對(duì)照品適量,精密稱定,加水溶解并定量制成每毫升含磺芐西林60 μg的溶液,以流動(dòng)相B進(jìn)樣測(cè)定。

2.3.2 供試品溶液 取本品約0.3 g,精密稱定,置10 mL量瓶,加水適量,使溶解后,用水稀釋至刻度,搖勻,以流動(dòng)相A立即進(jìn)樣測(cè)定(圖2)。

圖1 分離度實(shí)驗(yàn)色譜圖

圖2 供試品的聚合物圖譜(流動(dòng)相A)1.高分子聚合物;2.磺芐西林鈉

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 已知用藍(lán)色葡聚糖2000溶液實(shí)驗(yàn)測(cè)得的流出時(shí)間(圖3),即為Kav=0。在上述規(guī)定的色譜條件下,在Kav=0時(shí),樣品中有一峰流出(tR為8.6 min),至12 min后藥物單體開(kāi)始流出(圖4),且分離度符合要求。故確認(rèn)為tR為8.6 min時(shí)的峰即為聚合物峰。

2.5 對(duì)照溶液線性關(guān)系考察 精密稱取磺芐西林鈉對(duì)照品14.40 mg,置25 mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻。用水逐步精密稀釋,制成分別含磺芐西林5.93, 29.67,59.33,118.66,237.31和474.62 μg·mL-1的溶液,分別按“2.1”項(xiàng)色譜條件以流動(dòng)相B進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程Y=406.84X+1 679.1,r= 0.9999,表明對(duì)照品溶液濃度在5.9～474.6 μg·mL-1范圍內(nèi)(進(jìn)樣100 μL),溶液濃度與測(cè)得的峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖3 流動(dòng)相B中藍(lán)色葡聚糖2 000(A)與對(duì)照溶液(B)的色譜圖比較

2.6 定量限與檢測(cè)限 取“2.5”項(xiàng)5.93 μg·mL-1溶液,精密稀釋10倍,按“2.1”項(xiàng)色譜條件以流動(dòng)相B進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,并對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行基線檢測(cè),結(jié)果最低檢測(cè)濃度為1.02 μg·mL-1(S/N=3),計(jì)算最低檢測(cè)限為0.003%,最低檢測(cè)量0.102 μg,最低定量限0.01%(S/N=10)。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取磺芐西林鈉對(duì)照品18.96 mg,置于250 mL量瓶,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取100 μL注入液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)色譜條件,以流動(dòng)相B為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定。連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄色譜圖,以峰面積計(jì)算,RSD為4.1%,小于5.0%,說(shuō)明精密度良好[3]。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取注射用磺芐西林鈉樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號(hào):080501)約0.3 g,稱取5份,分別置10 mL量瓶,用水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液;另取精密度實(shí)驗(yàn)溶液,作為對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,分別精密量取100 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。含磺芐西林聚合物以磺芐西林計(jì),結(jié)果分別為0.12%,0.11%, 0.10%,0.11%,0.11%,RSD=4.3%,表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號(hào):080501),在不同日期按“2.8”項(xiàng)方法共測(cè)定3次,結(jié)果分別為0.11%,0.12%,0.11%,RSD=4.8%,表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 樣品取樣量對(duì)聚合物測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性考察 分別取樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號(hào):080501) 200,300,400 mg,置3個(gè)10 mL量瓶,按“2.1”項(xiàng)色譜條件以流動(dòng)相A進(jìn)行測(cè)定。以供試品濃度(C, mg·mL-1)為橫坐標(biāo),高分子聚合物峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程Y=371.87X+4 820.5,r= 0.999 4,表明供試品溶液濃度在20.68～40.48 mg·mL-1范圍內(nèi)(進(jìn)樣100 μL),供試品溶液濃度與測(cè)得的高分子聚合物峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.11 樣品的聚合物測(cè)定 按“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)方法及“2.1”項(xiàng)色譜條件,測(cè)定2批樣品磺芐西林聚合物(表1)。

表1 樣品中高分子聚合物測(cè)定結(jié)果 %

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 流動(dòng)相A:流動(dòng)相的種類和濃度可以改變?nèi)苜|(zhì)的色譜行為和分離效果[7],故選用pH 7.0的0.1,0.05,0.025 mol·L-1磷酸鹽緩沖液分別作為流動(dòng)相A,流速均為1.5 mL·min-1。在pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相A時(shí)分離最好,故選用pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相A。

流動(dòng)相B:選用水作為流動(dòng)相B,用每毫升約含60 μg的磺芐西林鈉溶液,進(jìn)樣100 μL進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明磺芐西林鈉在以水作為流動(dòng)相的條件下能完全締合形成表觀分子量較大的締合物,在Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)中的色譜行為與聚合物相似,都在Kvo= 0處流出,表現(xiàn)為單一色譜峰,故采用自身對(duì)照外標(biāo)法。

3.2 流速的選擇 選用pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相A時(shí),比較流速為1.0和1.5 mL·min-1的分離情況,可見(jiàn)二者分離都較好。因流速為1.5 mL·min-1時(shí)分離好且較快出峰,故選用該流速。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中選用比文獻(xiàn)[6-7]鹽濃度更高的緩沖液及更快的流速,使得整個(gè)樣品的分析時(shí)間縮短一半以上,且分離效果更好。故本實(shí)驗(yàn)建立的注射用磺芐西林鈉高分子聚合物檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,對(duì)于保證藥品質(zhì)量和用藥安全均具有重要的意義。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.033

R978.1;R927.1

A

1004-0781(2014)03-0386-03

2013-02-18

2013-03-20

阮昊(1981-),女,浙江杭州人,主管藥師,碩士,主要從事抗生素藥品質(zhì)量研究。電話:0571-86459427,E-mail：clare_ruan@163.com。

陳悅(1971-),男,浙江永康人,主任藥師,學(xué)士,主要從事抗生素藥品質(zhì)量研究。電話:0571-86459427,E-mail：13868057010@163.com。