樺褐孔菌多糖對抗結核藥物所致肝損傷小鼠的保護作用*

鐘秀宏,楊淑艷,趙麗微,鄭中華,張以忠,王爽,鐘越,郭敏,楊寧江

(1.吉林醫藥學院病理教研室,吉林 132013；2.吉林醫藥學院附屬醫院,吉林 132013)

樺褐孔菌多糖對抗結核藥物所致肝損傷小鼠的保護作用*

鐘秀宏1,楊淑艷1,趙麗微1,鄭中華1,張以忠1,王爽1,鐘越1,郭敏2,楊寧江2

(1.吉林醫藥學院病理教研室,吉林 132013；2.吉林醫藥學院附屬醫院,吉林 132013)

目的 探討樺褐孔菌多糖對異煙肼和利福平合用所致肝損傷小鼠的保護作用及其機制。方法48只小鼠隨機分為對照組,模型組,護肝片組,樺褐孔菌多糖低、中和高劑量組共6組,每組8只。除對照組外,其余各組每天采用異煙肼和利福平灌胃造成肝損傷模型,2 h后,對照組和模型組分別予以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,其余各組分別予以護肝片、樺褐孔菌多糖灌胃,連續2周。分別檢測各組小鼠肝指數和血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)的活性,肝組織勻漿丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性,并做肝組織病理學檢查。結果樺褐孔菌多糖低、中、高劑量組和護肝片組肝指數、血清ALT和AST活性、肝勻漿MDA含量均明顯降低,肝勻漿SOD的活性顯著提高。樺褐孔菌多糖低、中、高劑量組肝細胞變性和壞死程度明顯減輕,肝組織的病理改變緩解。結論樺褐孔菌多糖對異煙肼和利福平所致肝損傷小鼠具有明顯的保護作用,其機制可能與其抗氧化作用有關。

樺褐孔菌多糖;異煙肼;利福平;損傷,肝;保護作用

異煙肼和利福平是目前抗結核病常用的一線藥物,但二者合用肝毒性發生率增加[1-3],嚴重影響了患者的健康和抗結核病的療效。因此尋找既能增強異煙肼和利福平療效,又能對抗其不良反應的藥物,顯得很有必要。研究表明,樺褐孔菌具有免疫調節、抗癌及阻止腫瘤轉移、抗炎、調整血脂、抗脂質過氧化等功效[4],其抗氧化和降低血脂的作用正日益受到關注。樺褐孔菌通過抗脂質過氧化反應對化學性肝損傷有一定的保護作用[5],但對抗結核藥致肝損傷的保護作用筆者未見報道。筆者在本實驗中通過觀察異煙肼和利福平聯合用藥致肝損傷小鼠在給予樺褐孔菌多糖前后各指標的變化,探討樺褐孔菌對異煙肼和利福平致肝損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級小鼠48只,雌雄各半,體質量20～25 g,購自吉林大學實驗動物中心,動物許可證號: SCXK(吉)2008-0005。環境溫度(22±2)℃,自由攝食與飲水。

1.2 藥品與試劑 異煙肼片(規格:每片0.1 g,山西太原藥業有限公司,批號:090101)；利福平膠囊(規格:每粒0.15 g,沈陽紅旗制藥有限公司,批號:1001131)；護肝片(吉林省羅邦藥業有限公司,批號:20080505),使用時用0.9%氯化鈉溶液溶解,配制相應濃度。丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)試劑盒(濰坊三維生物工程有限公司,批號:100401),考馬斯亮藍測定試劑盒(南京生物制品研究所,批號:20100428)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。其他試劑均用國產分析純。樺褐孔菌精制多糖(純度98%)由河南大學藥學院趙芬琴博士制備并提供。

1.3 儀器 ZMN-7803型全自動組織包埋機,常州市華利電子有限公司生產；TD5A型臺式低速離心機,湖南凱達科學儀器有限公司生產；AG135電子分析天平,上海精密科學儀器有限公司生產；電熱恒溫水浴鍋,北京醫療設備廠生產；SelectraXL型全自動生化分析儀,荷蘭威圖儀器有限公司生產；722型紫外分光光度計,上海欣茂儀器有限公司生產。

1.4 方法

1.4.1 抗結核藥致小鼠急性肝損傷模型的制備與藥物處理 小鼠適應性喂養飼養1周后,雌雄分開,采用隨機分組法將其分為對照組,模型組,護肝片組,樺褐孔菌低、中、高劑量組,共6組,每組8只。除對照組外,其余5組小鼠一次性灌胃異煙肼和利福平各75 mg·kg-1·d-1,灌胃體積為20 m L·kg-1,以造成肝損傷模型[6],對照組則灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。在給予異煙肼和利福平2 h后,護肝片組給護肝片1 400 mg·kg-1·d-1,樺褐孔菌多糖低、中和高劑量組分別灌胃100,200,400 mg·kg-1·d-1樺褐孔菌多糖,正常組和模型組均灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液,各組灌胃體積均為20 mL·kg-1,連續給藥2周。

1.4.2 標本采集 全部小鼠末次給藥禁食不禁水16 h后,稱體質量,摘眼球取血,制備血清后檢測ALT和AST活性。迅速取肝稱質量,然后取相同部分肝葉置于10%甲醛溶液固定,部分肝制成10%肝組織勻漿液,4 000 r·min-1離心10 min,取適量上清液,進行MDA、SOD和GPx含量測定。

1.4.3 指標檢測 ①肝指數及形態學觀察:計算肝指數(肝質量/小鼠質量×100%),取部分肝葉固定,包埋,切片,染色,進行肝形態學觀察。②ALT和AST活性測定:摘取眼球取血,用全自動生化分析儀測定AST、ALT水平。③肝勻漿MDA、SOD和GPx含量測定:按試劑盒說明進行操作。

1.5 統計學方法 采用SPSS14.0版統計學軟件進行數據分析。數據用均數±標準差()表示,組間比較用方差分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樺褐孔菌多糖對抗結核藥所致肝損傷小鼠肝指數的影響 對照組,模型組,護肝片組,樺褐孔菌低、中、高劑量組小鼠肝指數分別為(5.37±0.27)%, (6.39±0.54)%,(5.55±0.26)%,(5.45±0.25)%, (5.52±0.27)%,(5.65±0.24)%。與對照組比較,模型組肝指數增加(P＜0.01)；與模型組比較,樺褐孔菌低、中、高劑量組肝指數均降低(均P＜0.01)。

2.2 樺褐孔菌多糖對抗結核藥所致肝損傷病理形態學的影響 光鏡下,對照組肝細胞結構正常,肝細胞索清晰,圍繞中央靜脈呈放射狀排列:模型組可見肝小葉排列整齊,大部分肝細胞水腫變性加重,肝竇受壓變窄,有氣球樣變,嗜酸性變,點狀壞死病灶,并見炎細胞浸潤,與模型組比較,各給藥組病理改變改善明顯,水腫變性減輕,樺褐孔菌多糖組以高劑量為顯著。結果見圖1。

2.3 樺褐孔菌多糖對抗結核藥所致肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響 見表1。與對照組比較,模型組ALT和AST的活性增加(P＜0.01)。與模型組比較,樺褐孔菌低、中、高劑量組ALT和AST的活性均降低(均P＜0.01)。

2.4 樺褐孔菌多糖對抗結核藥所致肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、SOD和GPx的影響 與對照組比較,模型組MDA的含量升高(P＜0.01)。與模型組比較,樺褐孔菌多糖各劑量組MDA的含量均降低(P＜0.05或P＜0.01)。與對照組比較,模型組SOD的含量降低(P＜0.01)。與模型組比較,樺褐孔菌多糖各劑量組SOD的含量均降低(均P＜0.01)。與對照組比較,模型組GPx的含量降低(P＜0.01)。與模型組比較,樺褐孔菌多糖各劑量組GPx的含量均升高(均P＜0.01)。結果見表2。

3 討論

血清中AST和ALT是用于診斷肝實質損害的主要酶類[7-8]。本實驗中,從形態學和血清學檢查可以看出,模型組小鼠肝細胞變性壞死,血清AST和ALT升高,均提示小鼠肝細胞已經發生損傷,模型復制成功。樺褐孔菌多糖組與模型組比較,小鼠肝細胞變性壞死程度明顯減輕,血清AST和ALT明顯降低,表明樺褐孔菌多糖對抗結核藥引起的肝細胞膜結構和功能的破壞具有保護作用,能提高細胞膜穩定性。

A.對照組;B.模型組;C.護肝片組;D.樺褐孔菌低劑量組;E.樺褐孔菌中劑量組;F.樺褐孔菌高劑量組圖1 6組小鼠肝組織病理形態學比較(×100)A.the control group；B.the model group；C.hugan tablet group；D.low dose of inonotus obliquus group；E.middle dose of inonotus obliquus group；F.high dose of inonotus obliquus groupFig.1 Com parison of hepatic pathomorphology among six groups ofmice(×100)

表1 6組小鼠血清ALT和AST比較Tab.1 Comparison of ALT and AST in serum among six groups of mice U·L-1,

表1 6組小鼠血清ALT和AST比較Tab.1 Comparison of ALT and AST in serum among six groups of mice U·L-1,

與對照組比較,*1P＜0.01;與模型組比較,*2P＜0.01Compared with the control group,*1P＜0.01;compared with the model group,*2P＜0.01

組別小鼠/只劑量/ (mg·kg-1)ALT AST對照組8…49.67±7.64 69.83±10.11模型組8…208.80±116.26 106.28±17.30*1護肝片組8 1 400 62.25±9.43 76.16±10.02*2樺褐孔菌多糖低劑量組8 100 67.65±9.86 87.23±9.21*2中劑量組8 200 61.56±5.65 79.23±15.01*2高劑量組8 400 50.05±3.32 74.83±13.00*2

異煙肼和利福平致肝損傷機制目前認為是利福平誘導了肝藥酶,加速了乙酰異煙肼代謝為乙酰肼,而其代謝物乙酰肼可通過酶系統與非酶系統產生自由基,進而攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸,引發脂質過氧化作用,并因此形成包括MDA在內的脂質過氧化物。MDA是脂質過氧化反應的終產物,既能反映體內脂質過氧化的水平,也能作為機體損傷的損傷因子。實驗結果顯示:模型組與對照組比較,肝組織中MDA含量升高；樺褐孔菌多糖組與模型組比較,肝組織中MDA含量減低,進一步證明脂質過氧化與肝損傷的發病機制有關,也說明樺褐孔菌多糖有抗損傷的作用,此作用可能與抑制或清除自由基有關。

SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要作用,能清除超氧陰離子自由基(O2-)保護細胞免受損傷,間接反映了機體清除自由基的能力；GPx是機體內廣泛存在的一種含硒抗氧化酶,可通過特異性催化谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應,而清除細胞內有害的過氧化代謝產物,以阻斷脂質過氧化連鎖反應,從而對細胞代謝的正常進行起到重要作用。本實驗中,模型組SOD和GPx明顯降低,樺褐孔菌多糖各劑量組SOD和GPx較模型組明顯升高,呈劑量效應關系。由此推斷,樺褐孔菌多糖可能是通過提高SOD和GPx活性,增強內源性氧自由基清除系統的功能,減少由氧自由基作用膜脂質生成的脂質過氧化物MDA引起的肝損傷,對抗結核藥引起的藥物性肝損傷有一定的防治效果。

表2 6組小鼠肝勻漿中M DA、SOD和GPx的含量比較Tab.2 Comparison of the contents of M DA,SOD and GPx in liver homogenate among six groups of mice

表2 6組小鼠肝勻漿中M DA、SOD和GPx的含量比較Tab.2 Comparison of the contents of M DA,SOD and GPx in liver homogenate among six groups of mice

與對照組比較,*1P＜0.01;與模型組比較,*2P＜0.05,*3P＜0.01Compared with the control group,*1P＜0.01;compared with the model group,*2P＜0.05,*3P＜0.01

組別小鼠/只劑量/ (mg·kg-1) MDA/ (nmol·mg-1) SOD/ (U·mg-1) GPx/ (μmol·L-1)對照組8…0.91±0.19 118.27±9.41 3.67±0.45模型組8 1.12±0.11*192.56±9.10*12.17±0.51*1護肝片組8 1 400 0.95±0.15*2108.14±9.93*33.56±0.72*3樺褐孔菌多糖低劑量組8 100 1.08±0.13*2110.81±4.31*33.63±0.67*3中劑量組8 200 0.99±0.14*3113.88±5.01*33.78±0.76*3高劑量組8 400 0.93±0.12*3116.88±4.01*33.88±0.65*3

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.002

Protective Effects of Inonotus Obliquus Polysaccharide on Liver Injury Induced by Antituberculosis Drugs in Mice

ZHONG Xiu-hong1,YANG Shu-yan1,ZHAO Li-wei1,ZHENG Zhong-hua1,ZHANG Yi-zhong1,WANG Shuang1,ZHONG Yue1,GUO Min2,YANG Ning-jiang2
(1.Department of Pathology,College of Pharmacy, Jilin Medical College,Jilin 132013,China;2.Affiliated Hospital of Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo study the protective effect and mechanism ofInonotus obliquuspolysaccharide on liver injury induced by isoniazid(INH)combined with rifampicin(RFP)inmice.MethodsForty-eightmicewere randomly divided into six groups(control,model,hugan pian,Inonotus obliquuspolysaccharide at low,middle,and high dose).Themice were administered orally with isoniazid and rifampicin simultaneously except the control.After2 h,the control andmodel groupswere administered with normal saline,and others were treated withhugan pianandInonotus obliquuspolysaccharide,respectively,once a day for 2 weeks. The liver index and serum levels of ALT and AST,malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase (GPx)weremeasured.Pathology examination of liver tissue was performed.ResultsThe activities of ALT and AST,liver index, content ofMDA in liver homogenate of mice treated withInonotus obliquuspolysaccharide andhugan piandecreased obviously,while the liver SOD activity increased.Histopathological exzamination showed thatInonotus obliquuspolysaccharide alleviated the degeneration and necrosis of hepatic cells.ConclusionInonotus obliquuspolysaccharide shows protective effects on mice with hepatic toxic injury induced by isoniazid and rifampicin,which maybe due to its antioxidation effect.

Inonotus obliquuspolysaccharide;Isoniazid;Rifampicin;Injury,liver;Protective effect

R975.5;R285.5

A

1004-0781(2014)05-0558-04

2013-06-28

2013-08-20

*吉林省衛生廳基金資助項目(2012zc018)；吉林市科技發展計劃項目(201032242)

鐘秀宏(1971-),女,畬族,浙江金華人,副教授,碩士,主要從事中藥防護研究工作。電話:(0) 15144288179,E-mail:xhzhong0611@163.com。

楊寧江(1963-),男,吉林人,教授,碩士,主要從事病理形態學研究。電話:(0)13944272845,E-mail:yangningjiang465@163.com。