丹紅注射液對SMMC-7721肝癌細胞的促凋亡作用

仲蕾,徐立平,錢先中,金慧靜,陳超,仵利軍

(解放軍第100醫院藥械科,蘇州 215007)

丹紅注射液對SMMC-7721肝癌細胞的促凋亡作用

仲蕾,徐立平,錢先中,金慧靜,陳超,仵利軍

(解放軍第100醫院藥械科,蘇州 215007)

目的 研究丹紅注射液對SMMC-7721肝癌細胞凋亡的作用。方法將0,2,4,8μL·mL-1丹紅注射液分別作用人肝癌細胞系SMMC-7721,在顯微鏡下觀察不同濃度丹紅注射液對細胞形態的影響,選擇2μL·mL-1作用后,0, 6,12,24 h流式細胞儀檢測細胞凋亡指數變化;以噻唑藍(MTT)法檢測不同濃度丹紅注射液對SMMC-7721肝癌細胞增殖的影響;逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測p53、Bax、Bcl-2在含不同濃度藥物的SMMC-7721細胞中表達。結果隨著藥物濃度增大,SMMC-7721的凋亡形態越明顯,并且隨作用時間的延長,細胞凋亡指數也增加;不同濃度丹紅注射液對SMMC-7721細胞均有明顯的劑量和時間依賴性;不同濃度藥物可誘導SMMC-7721肝癌細胞凋亡;隨著丹紅注射液濃度增加,Bcl-2在SMMC-7721細胞中的表達降低,p53和Bax的表達增高。結論丹紅注射液能促進SMMC-7721細胞的凋亡,且具有一定的劑量和時間依賴性。

丹紅注射液;SMMC-7721肝癌細胞;凋亡

丹紅注射液是將中藥丹參、紅花按科學配方提取的復方制劑。丹參為唇形科植物,具有活血祛痕、養血安神、調經鎮痛、涼血消癰的功效。紅花為菊科植物的干燥管狀花,具有活血通經、散癖鎮痛的功效。研究表明,活血化瘀藥物可抑制肝癌細胞生長,促進腫瘤細胞凋亡,而丹紅注射液是常用的活血化瘀藥物,故筆者選擇此藥做進一步研究。丹參主要通過抑制細胞增殖、促進凋亡以及促進分化等機制發揮抗腫瘤作用,對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用和分化誘導作用[1]。體外研究表明,丹參類化合物可抑制多種腫瘤細胞增殖,影響細胞周期分布。筆者主要研究丹紅注射液對SMMC-7721細胞毒性和細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人肝癌細胞株SMMC-7721由蘇州大學細胞與分子教研室提供。細胞培養于RPMI1640 (GIBCO公司)培養液中,含10%滅活小牛血清, 37℃,5%二氧化碳(CO2)。

1.2 藥物處理 丹紅注射液(10 mL,6支),由菏澤步長制藥有限公司生產,批準文號:國藥準字Z20026866。細胞按2×105接種于6孔板中,待細胞貼壁后,根據預實驗及臨床用藥量,將丹紅注射液作用濃度按0,2,4,8μL·mL-1分組,每孔2 mL,以0μL·mL-1為陰性對照組。藥物共同作用3 d后,進行以下指標觀察。

1.3 細胞凋亡形態觀察及細胞凋亡指數的測定 細胞按每孔2×105個接種于6孔板中,待細胞貼壁后,根據預實驗及臨床用藥量,將丹紅注射液作用濃度按0, 2,4,8μL·mL-1分組,加藥作用3 d后在顯微鏡下觀察,攝相。每孔2 mL,以0μL·mL-1為陰性對照組,其后以2μL·m L-1作用肝癌細胞,分別于0,6,12,24 h收集細胞,流式細胞儀檢測各時間點細胞的凋亡指數。

1.4 噻唑藍法檢測丹紅注射液對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用 取處于對數生長期的SMMC-7721細胞,按每孔5×103個接種于96孔板,分別于鋪板第1, 2,3天時每孔加入5 mg·mL-1噻唑藍溶液10μL,置于細胞培養箱中作用4 h,然后每孔加入10%十二烷基苯磺酸鈉-鹽酸溶液100μL以溶解細胞內形成的藍紫色結晶體,作用3～6 h。第4天時酶標儀570 nm處測定吸光度(A570)值,每個時間設3個復孔。按以下公式計算促進/抑制率:細胞增殖促進/抑制率(%)= (1-實驗組A570值/對照組A570值)×100%

1.5 膜聯蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)雙染檢測細胞凋亡 用0.25%不含依地酸二鈉的胰蛋白酶溶液消化各組細胞,制成單細胞懸液后移入1.5 mL離心管中,2 000 r·min-1(r=8 cm)離心5 min；加入磷酸鹽緩沖溶液洗滌細胞沉淀2次,收集(1～5)×105個細胞；加入重懸細胞結合緩沖液500μL；加入Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)溶液5μL混勻,加入PI溶液5μL,混勻,室溫,避光反應15 min；1 h內進行流式細胞儀檢測,激發波長488 nm,發射波長530 nm。

1.6 逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptasepolymerase chain recation,RT-PCR)檢測凋亡相關基因在SMMC-7721細胞中的表達

1.6.1 總RNA的抽提 用胰酶消化收集各組細胞(各約106個)于無菌的1.5 mL離心管中；用磷酸鹽緩沖溶液洗滌一次細胞后加入Trizol試劑1 mL,劇烈振蕩至細胞沉淀充分溶解消失；加入三氯甲烷溶液200μL,劇烈顛倒20次,充分混勻,放置5 min,4℃、12 000×g離心15 min；棄去上清液,干燥,加焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)溶液20～50μL溶解沉淀。

1.6.2 RT-PCR反應 用逆轉錄反應體系20μL合成cDNA,以所得到的cDNA作為模板,進行PCR擴增。取PCR產物和DNA Marker各5μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統觀察電泳結果。

p53:上游引物5′-TTG GAT CCA TGT TTT GCC AAC TGG CC-3′

下游引物5′-TTG AAT TCA GGC TCC CCT TTC TTG CG-3′

Bcl-2:上游引物5′-TGT GGC CTT CTT TGA ATT CG-3′

下游引物5′-CTA CCC AGC CTC CGT TAT CC-3′

Bax:上游引物5′-GGA TGCGTCCAC CAA GAA-3′

下游引物5′-GCA CTC CCG CCA CAA AGA-3′

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH):上游引物5′-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA-3′

下游引物5′-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3′

2 結果

2.1 丹紅注射液對SMMC-7721細胞形態的影響及細胞凋亡指數的測定

2.1.1 丹紅注射液對SMMC-7721細胞形態的影響SMMC-7721細胞按不同加藥濃度進行培養,倒置顯微鏡下觀察。對照組細胞密度高,體積規則呈正常梭形,正常細胞98%,凋亡細胞2%。隨著藥物濃度的增大,凋亡細胞明顯增多,細胞由梭形變成圓形,皺縮、部分細胞從瓶壁脫落,懸浮在培養液中。隨加藥劑量增大,細胞脫落增加。2μL·m L-1劑量組開始出現凋亡狀態,8μL·m L-1劑量組細胞基本脫落死亡(圖1)。

2.1.2 細胞凋亡指數的測定 凋亡指數為凋亡細胞所占測定細胞總數的百分率,選用2μL·mL-1丹紅注射液進一步觀察,以0 h未加藥時為對照組,6及12 h時肝癌細胞凋亡指數較對照組逐漸增加(圖2),作用24 h后細胞凋亡指數與對照組0 h比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 丹紅注射液對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用

不同濃度的丹紅注射液分別給藥24,48,72 h后,對SMMC-7721細胞的生長呈明顯抑制作用(圖3)。結果表明細胞增殖的抑制率與藥物濃度及作用時間密切相關,單因素方差分析結果表明不同藥物濃度與對照組間細胞抑制率差異有統計學意義(P＜0.05),隨著藥物濃度和作用時間的增加,對細胞增殖的抑制作用越明顯。

2.3 丹紅注射液誘導SMMC-7721細胞凋亡的作用SMMC-7721細胞經不同組別處理,PI染色后使用流式細胞儀進行監測分析。結果表明:丹紅注射液可以誘導細胞凋亡,隨給藥時間的增加誘導細胞凋亡的作用逐漸增強。對照組凋亡比例為7.63%,給藥后的細胞凋亡比例升高,2,4,8μL·mL-1丹紅注射液組細胞凋亡比例分別為8.28%,12.35%,33.86%,與對照組比較均差異有統計學意義(均P＜0.05)。細胞凋亡比例隨藥物濃度增大而逐漸增大(圖4,5)。

2.4 RT-PCR檢測細胞中凋亡相關基因的表達 抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax是Bcl-2家族成員,二者比例決定了細胞對凋亡信號的反應。RT-PCR法檢測促凋亡基因Bax、p53和抗凋亡基因Bcl-2轉錄情況。與對照組相比,丹紅注射液組促凋亡基因Bax mRNA和p53 mRNA表達量隨著加藥劑量的升高而增強；抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達量隨著加藥劑量的升高而下降(圖6)。利用Bandscan軟件掃描半定量分析條帶的灰度值,結果見圖7,與對照組相比,促凋亡基因Bax和p53 mRNA相對表達量相對增加(P＜0.05)；抗凋亡基因Bcl-2相對表達量降低(P＜0.05)。

A.對照組;B.2μL·mL-1丹紅注射液組;C.4μL·mL-1丹紅注射液組;D.8μL·mL-1丹紅注射液組圖1 4組細胞形態觀察(40×10)A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong Injection groupFig.1 Morphology of four groups of cells(40×10)

圖2 2μL·m L-1丹紅注射液處理SMMC-7721細胞24 h細胞凋亡指數的變化Fig.2 Apoptosis index of SMMC-7721 cells after treatment w ith 2μL·m L-1danhong injection for 24 h

圖3 丹紅注射液對SMMC-7721細胞生長的作用Fig.3 Effect of danhong injection on the grow th of hepatoma cells

3 討論

腫瘤是在遺傳基礎上多種致瘤因素作用的結果,細胞失去了正常分化的能力,異常增殖形成新生物,喪失了正常的生理功能。惡性腫瘤具有局部浸潤和遠處轉移的特性。本研究顯示,丹紅注射液作用后,SMMC-7721細胞一部分發生凋亡,且具有時間和劑量依賴性,隨著藥物劑量的增加,細胞的凋亡率增大。經典的細胞凋亡途徑包括受體介導途徑和線粒體介導途徑。線粒體介導的細胞凋亡途徑通過Bcl-2家族調節。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白[2-3]。抗凋亡蛋白Bc1-2與促凋亡蛋白Bax的比例,即Bcl-2/Bax異源二聚體與Bax/Bax同源二聚體的比例,決定了細胞對凋亡信號的反應,即生存還是死亡[4]。Bax是一種很重要的促凋亡基因,其表達產物常以Bax/Bax同源二聚體形成來誘導細胞凋亡,起到加速細胞凋亡的作用。

A.對照組;B.2μL·mL-1丹紅注射液組;C.4μL·mL-1丹紅注射液組;D.8μL·mL-1丹紅注射液組圖4 4組細胞的凋亡圖A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.4 Apoptosis of fou r groups of cells

A.對照組;B.2μL·mL-1丹紅注射液組;C.4μL·mL-1丹紅注射液組;D.8μL·m L-1丹紅注射液組圖5 4組細胞的凋亡指數比較A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.5 Comparison of the apoptosis index am ong 4 groups of cells

A.對照組;B.2μL·mL-1丹紅注射液組;C.4μL·mL-1丹紅注射液組;D.8μL·m L-1丹紅注射液組圖6 4組細胞凋亡相關基因的mRNA轉錄水平A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·m L-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.6 mRNA transcription levels of apoptosis related gene in four groups of cells

圖7 Bax、p53和Bcl-2在4組細胞株中的mRNA表達Fig.7 mRNA expression of Bax,p53 and Bcl-2 in four groups of cells

筆者采用RT-PCR法檢測了凋亡相關基因的變化,結果表明促凋亡基因Bax和p53表達上調,抗凋亡基因Bcl-2表達下調,故其Bax/Bcl-2明顯升高,提示丹紅注射液抗凋亡可能是通過上調Bax表達和下調Bcl-2表達實現的。但目前其作用機制尚不明確,有待于進一步研究。腫瘤的發生和發展不僅與細胞的分化異常及增殖過度有關,而且與細胞凋亡的減少密切相關,而一旦細胞增殖與凋亡失控,則可導致腫瘤的發生[5]。本研究將結果顯示,丹紅注射液能抑制肝癌的生長,并能誘導其凋亡,這為傳統中藥用于腫瘤治療開拓了新的思路。

[1] 鄭謹,劉強,史恒軍,等.丹紅注射液促肝癌細胞凋亡及NDRG2表達的初步研究[J].山西醫科大學學報,2010, 41(12):1009-1010.

[2] 李敏,谷俊俠,楊慧翠,等.RMP在γ射線誘導的肝癌細胞凋亡中的表達[J].蘇州大學學報:醫學版,2009,50 (1):21-23.

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.004

Pro-Apoptosis Effects of Danhong Injection on the SMMC-7721 Hepatoma Cells

ZHONG Lei,XU Li-ping,QIAN Xian-zhong,JIN Hui-jing,CHEN Chao,WU Li-jun
(Department of Pharmacy and Apparatus,the 100thHospital of PLA,Suzhou 215007,China)

ObjectiveTo investigate the effects ofdanhonginjection on theapoptosis of SMMC-7721 heptoma cells.MethodsThe hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 was incubated with different concentrations(0,2,4,8μL·mL-1) ofdanhonginjection,and cellmorphology was studied under themicroscope.The apoptosis index was detected by flow cytometry at 0,6,12,24 h after cultured with 2μL·m L-1danhonginjection.Cell proliferation was measured by MTT assay;Gene expressions of p53,Bax and Bcl-2 were detected by RT-PCR at different drug concentrations.ResultsThemorphology of the hepatoma cells changed obviously,and the apoptosis index increased bydanhonginjection in a dose-dependant manner.Thedanhonginjection decreased gene expressions of Bcl-2,and obviously increased p53 and Bax.ConclusionDanhonginjection can dose-and time-dependently promote apoptosis of SMMC-7721 cells.

Danhonginjection;SMMC-7721 hepatoma cells;Apoptosis

R286;R979.1

A

1004-0781(2014)05-0565-04

2013-03-22

2013-05-07

仲蕾(1987-),女,江蘇蘇州人,碩士,研究方向:藥理學。電話:(0)18629057786,E-mail:zhongleiqin@126.com。

仵利軍(1978-),男,浙江湖州人,主管藥師,研究方向:藥事管理學。電話:(0)15195607766,E-mail:410385634@qq.com。