月光花豆乙醇提取物對急性肺損傷大鼠的保護作用

唐秀能,韋紅棉,黃仁彬

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室,南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,南寧 530011)

月光花豆乙醇提取物對急性肺損傷大鼠的保護作用

唐秀能1,2,韋紅棉1,黃仁彬2

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室,南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,南寧 530011)

目的 探討月光花豆乙醇提取物(CABE)對急性肺損傷(ALI)大鼠的保護作用。方法大鼠尾靜脈注射脂多糖5 mg·kg-1復(fù)制ALI模型,免疫組化法測定大鼠肺組織中核因子-κBp65(NF-κB p65)的表達,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定肺組織白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的含量,同時觀察肺組織病理形態(tài)、肺組織的濕干質(zhì)量比例(W/D)和肺組織髓過氧化物酶(MPO)的活性。結(jié)果模型大鼠和CABE治療大鼠肺組織W/D分別為5.05±0.24,4.35±0.21;IL-1β含量分別為(320.60±19.73),(294.42±13.95)pg·mL-1;MPO活性分別為(1.31±0.18),(1.04±0.18)U·g-1;與模型大鼠比較,CABE治療大鼠肺組織損傷減輕,IL-1β含量減少,肺組織W/D和MPO活性降低,NF-κB p65表達降低(P＜0.01)。結(jié)論CABE對脂多糖誘導(dǎo)的ALI大鼠具有明顯的保護作用,干擾NF-κB途徑和抑制IL-1β的生成可能是其作用機制之一。

月光花豆乙醇提取物;損傷,肺,急性;核因子;白細(xì)胞介素

月光花(Calonyction aculeatum)屬于旋花科(Convolvulaceae)一年生纏繞草本植物,主要分布于陜西、江蘇、浙江、江西、廣東、廣西、云南等地。月光花豆是月光花的朔果,有舒筋活絡(luò)、消腫鎮(zhèn)痛、活血化淤之功效,民間用于腰腿痛、風(fēng)濕痛、月經(jīng)痛、軟組織損傷等的治療,有較好療效。本課題組在前期藥效學(xué)實驗中發(fā)現(xiàn)月光花豆乙醇提取物(ethanol extract of calonyction acculeatum beans,CABE)能顯著抑制二甲苯致小鼠耳廓水腫反應(yīng)、醋酸誘發(fā)小鼠毛細(xì)血管通透性增高、角叉菜膠致大鼠和小鼠足腫脹程度及小鼠棉球肉芽腫生長,顯示有較好的抗炎作用。筆者在本實驗中通過研究CABE對急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的保護作用,進一步研究其抗炎作用,為月光花的開發(fā)和利用提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠,SPF級,體質(zhì)量(200±20)g,動物許可證號:SCXK(桂)2009-0002,由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 CABE由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供(CABE的制備:月光花豆適量粗粉碎,加10倍量70%乙醇,浸泡12 h后回流提取2 h,待冷卻后過濾,留第1次濾液；取第1次藥渣加8倍量70%乙醇,回流提取2 h,待冷卻后過濾,留第2次濾液。取第2次藥渣加8倍量70%乙醇,回流提取2 h,待冷卻過濾。合并3次濾液,于水浴冷卻裝置回收乙醇。收集提取液并進行減壓濃縮,得到濃縮物后,再分別配成所需的相應(yīng)濃度的CABE)。地塞米松磷酸鈉注射液(1 m L∶5 mg),天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司,批號:20101011；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),北京康為生物有限公司,批號:20101108；白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)試劑盒,晶美生物工程有限公司,批號:20101013；肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒,南京建成生物工程研究所,批號:20100506；免疫組織化學(xué)方法鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(streptavidin-biotincomplex,SABC)試劑盒,武漢博士德生物工程公司,批號:SA1022。

1.3 LPS致大鼠ALI模型的制備 將32只大鼠隨機分為4組,每組8只。模型組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)7 d,每天1次,末次給藥30 min后大鼠尾靜脈注射LPS 5 mg·kg-1,6 h后處死；正常組灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)7 d,每天1次,末次給藥后30 min后大鼠尾靜脈注射等體積0.9%氯化鈉溶液,6 h后處死；地塞米松組灌胃給予地塞米松3 mg·kg-1,連續(xù)7 d,每天1次,末次給藥30 min后大鼠尾靜脈注射LPS 5 mg·kg-1,6 h后處死；CABE組灌胃給予CABE(相當(dāng)于生藥3.50 g·kg-1),連續(xù)7 d,每天1次,末次給藥后30 min后大鼠尾靜脈注射LPS 5 mg·kg-1,6 h后處死。所有動物處死后開胸采集肺組織標(biāo)本[1-3]。

1.4 肺的濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值(W/D)測定 取出肺臟,迅速剝離左肺,用濾紙吸干表面血漬,分析電子天平稱濕質(zhì)量后置75℃烘烤箱內(nèi)烘干48 h至恒質(zhì)量,稱干質(zhì)量,計算肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量(W/D)值。

1.5 肺組織勻漿MPO活性及IL-1β含量測定 取右肺上葉稱質(zhì)量后勻漿,參照MPO檢測試劑盒分析肺組織中MPO的含量。取右肺中葉用0.9%氯化鈉溶液制成10%濃度勻漿,勻漿液經(jīng)3 000 r·min-1離心(r= 12 cm)10 min,取上清液參照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書檢測肺組織勻漿中細(xì)胞因子IL-1β的含量。

1.6 肺組織病理學(xué)檢查 取右肺下葉放入中性甲醛溶液固定24 h,70%乙醇脫水、修塊、石蠟包埋、切片,蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察切片組織的受損等情況。

1.7 核因子(nuclear factor,NF)-κB p65免疫組化檢測 取右肺下葉放入中性甲醛溶液固定24 h,70%乙醇脫水,石蠟包埋切片,孵育,抗原熱修復(fù),鏈霉親和素-生物素標(biāo)記法進行染色,二氨基聯(lián)苯胺顯色后封片。測定各組肺組織中NF-κB的表達強度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0版統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用成組t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠W/D、肺組織MPO活性和IL-1β含量與正常組比較,模型組大鼠的肺W/D、肺組織勻漿MPO活性及IL-1β含量均顯著增高(P＜0.01)；與模型組比較,地塞米松組、CABE組大鼠肺W/D、肺組織勻漿MPO活性及IL-1β均含量降低(P＜0.01),見表1。

2.2 大鼠肺組織的病理學(xué)變化 光鏡(10×10)觀察:正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡清晰,肺泡間隔無水腫及浸潤等改變。與CABE組、地塞米松組比較,模型組大鼠肺泡壁完整性破壞嚴(yán)重,肺間質(zhì)可見大量藍色炎癥細(xì)胞浸潤(藍色顆粒為炎性細(xì)胞),肺泡間間隔增寬,說明CABE與地塞米松可有效保護LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠,見圖1。

2.3 大鼠肺組織的NF-κB p65蛋白表達 經(jīng)處理后顯微鏡觀察NF-κB p65蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色。正常組NF-κB p65蛋白呈弱陽性或陰性,其陽性反應(yīng)產(chǎn)物多分布在細(xì)胞質(zhì)中。模型組NF-κB p65蛋白的表達增高,顯微鏡觀察可見細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)分布均勻的棕黃色顆粒,且大多數(shù)已進入細(xì)胞核,表明NF-κB p65已活化。地塞米松組、CABE組與模型組比較,棕黃色顆粒明顯減少,表明NF-κB p65蛋白的表達下降,見圖2。每張切片隨機選視野5個(40×10)觀察,每個視野細(xì)胞100個,計數(shù)NF-κB p65陽性細(xì)胞個數(shù),取其平均值,計算百分比,結(jié)果CABE組、地塞米松組、模型組、正常組肺組織NF-κB p65陽性細(xì)胞分別占(45.25± 12.42)%,(47.76±9.96)%,(65.25±8.78)%, (36.98±7.86)%,模型組明顯高于正常組(t=3.702,P＜0.01),CABE組和地塞米松組明顯低于模型組(t= 3.621,3.615,均P＜0.01)。

表1 4組大鼠肺W/D、MPO活性和IL-1β含量比較Tab.1 Comparison of the wet-dry weight ratio of lung,MPO activity and IL-1βcontent among four groups of rats

表1 4組大鼠肺W/D、MPO活性和IL-1β含量比較Tab.1 Comparison of the wet-dry weight ratio of lung,MPO activity and IL-1βcontent among four groups of rats

與正常組比較,*1P＜0.01;與模型組比較,*2P＜0.01Compared with the normal group,*1P＜0.01;compared with the model group,*2P＜0.01

組別劑量/(g·kg-1)大鼠/只W/D MPO/(U·g-1)IL-1β/(pg·mL-1)正常組…83.96±0.25 0.72±0.11 64.06±7.00模型組…8 5.05±0.24*11.31±0.18*1320.60±19.73*1地塞米松組0.003 8 4.21±0.19*20.99±0.20*2271.61±16.21*2CABE組3.50 8 4.35±0.21*21.04±0.18*2294.42±13.95*2

3 討論

ALI是各種直接或間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,主要特征為彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,可導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全,臨床主要表現(xiàn)為急性進行性呼吸困難和難治性低氧血癥,是急性呼吸窘迫綜合征的一種過渡階段[4]。大鼠尾靜脈注射LPS一直是ALI經(jīng)典建模方式之一,研究表明,5 mg·kg-1LPS尾靜脈注射即可導(dǎo)致ALI[5]。本實驗病理結(jié)果顯示,正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡清晰,肺泡間隔無水腫及浸潤等改變,而模型組大鼠肺泡壁完整性破壞嚴(yán)重,肺間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡間間隔增寬,肺部呈現(xiàn)急性炎癥表現(xiàn),證實本實驗ALI模型建立成功。

MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志,是反映組織中炎性反應(yīng)的重要指標(biāo),其水平及活性變化代表著中性多形核白細(xì)胞的功能和活性狀態(tài)[6]。MPO活性則可以判斷中性粒細(xì)胞在組織中浸潤情況。

NF-κB是參與炎癥反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,被激活后可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子大量表達,在各種細(xì)胞外刺激介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中起核心作用。在發(fā)生ALI的過程中,NF-κB途徑是一個極為重要的途徑[7-8]。許多炎癥因子(如IL-1β)在炎癥反應(yīng)的各個階段都受NF-κB的調(diào)控[9-10]。NF-κB的激活通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在第一時間對有害細(xì)胞的刺激做出反應(yīng),而不需要新翻譯出蛋白質(zhì)進行調(diào)控[11-12]。IL-1β作為前炎癥細(xì)胞因子,含有NF-κB的結(jié)合位點,當(dāng)NF-κB受內(nèi)外源性刺激由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移并活化后,啟動了炎癥級聯(lián)反應(yīng),對中性粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞聚集、遞質(zhì)釋放等炎癥過程中起關(guān)鍵作用,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的放大[13]。

A.正常組;B.模型組;C.地塞米松組;D.CABE組圖1 4組大鼠肺組織的病理學(xué)變化(10×10)A.normal group；B.model group；C.dexamethasone group；D.CABE groupFig.1 Pathological changes of lung tissue among four groups of rats(10×10)

A.正常組;B.模型組;C.地塞米松組;D.CABE組圖2 4組大鼠肺組織NF-κB p65蛋白的表達情況(40×10)A.normal group；B.model group；C.dexamethasone group；D.CABE groupFig.2 Expression of NF-κBp65 protein of lung tissue among four groups of rats(40×10)

本研究結(jié)果顯示,CABE可降低肺組織炎性病變,抑制MPO活性增加,調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子分泌。模型組大鼠肺組織中NF-κB p65和IL-1β的含量明顯升高,而CABE組大鼠肺組織中NF-κB的含量顯著減少,同時IL-1β的水平顯著降低,可推測CABE可能通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過度激活,進而減少炎性遞質(zhì)IL-1β的合成和釋放,是其對ALI的保護作用機制之一。

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.005

Protective Effects of Ethanol Extracts of Calonyction Acculeatum Beans on Rats with Acute Lung Injury

TANG Xiu-neng1,2,WEI Hong-mian1,HUANG Ren-bin2
(1.Department of Pharmacology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of ethanol extract ofcalonyction acculeatumbeans(CABE) on rats with acute lung injury(ALI).MethodsThe ALI model was induced via intravenous injection with 5 mg·kg-1lipopolysaccharide(LPS).The expression ofnuclear factor-κB p65(NF-κB p65)was determind by immunohistochemistry(IHC), and the content of interleukin-1β(IL-1β)in the lung tissue was detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Meanwhile,lung tissue histopathology,the wet-dry weight ratio of lung and the activity of myeloperoxidase(MPO)in the lung tissueswere observed.ResultsThe wet-dry weight ratio of lung of the model group and CABE treatment group was 5.05± 0.24,4.35±0.21,respectively;the content of IL-1βwas(320.60±19.73),(294.42±13.95)pg·mL-1,respectively;the MPO activity was(1.31±0.18),(1.04±0.18)U·g-1,respectively.Compared with the model group,CABE lessened the lung injury,decreased IL-1βlevel,reduced the lung dry-wet weight ratio and activity of MPO,and down-regulated the expression of NF-κB/p65(P＜0.05).ConclusionCABE has remarkedly protective effect on ALI induced by LPS in rats.One of the mechanismsmay be related to reducing the secretion of IL-1βand interfering with the activity of NF-κB.

Ethanol extract ofcalonyction acculeatumbeans;Injury,lung,acute;Nuclear factor;Interleukin

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)05-0569-04

2013-06-10

2013-09-26

唐秀能(1971-),男,廣西都安人,副主任藥師,碩士,主要從事臨床藥學(xué)、醫(yī)院藥事管理工作。電話:0771-2188067,E-mail:txnyaoshi2008@163.com。

韋紅棉(1976-),女,廣西都安人,主管護師,學(xué)士,主要從事醫(yī)院護理工作。電話:0771-2188067,E-mail:whmtyb@163.com。