急診重癥監護病房感染患者耐氨基苷鮑曼不動桿菌的耐藥機制

趙雪,于沛濤,徐芝君,顧清,裘力鋒,王弋

(1.杭州市第一人民醫院急診科,杭州 310003；2.北京大學基礎醫學院,北京 100191)

急診重癥監護病房感染患者耐氨基苷鮑曼不動桿菌的耐藥機制

趙雪1,于沛濤2,徐芝君1,顧清1,裘力鋒1,王弋1

(1.杭州市第一人民醫院急診科,杭州 310003；2.北京大學基礎醫學院,北京 100191)

目的 研究急診重癥監護病房(EICU)感染患者鮑曼不動桿菌16S rRNA甲基化酶armA、氨基苷核苷轉移酶ANT(3′′)-Ia、氨基苷磷酸轉移酶APH(3′)-I、氨基苷乙酰轉移酶AAC(6′)-Ib檢出率,分析耐氨基苷鮑曼不動桿菌的耐藥機制。方法收集48株鮑曼不動桿菌均經VITEK系統鑒定,并采用瓊脂對倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC),采用聚合酶鏈反應(PCR)法檢測酶基因。結果48株鮑曼不動桿菌中氨基苷類抗菌藥物高耐藥菌株28株,低耐藥菌株20株。高耐藥菌16S rRNA armA和低耐藥菌16S rRNA armA檢出率分別為71.43%和0.00%(P＜0.01),高耐藥菌APH (3′)-I和低耐藥菌APH(3′)-I檢出率分別為60.71%和5.00%(P＜0.01),高耐藥菌ANT(3′′)-Ia和低耐藥菌ANT(3′′)-Ia檢出率分別為82.14%和5.00%(P＜0.01),高耐藥菌AAC(6′)-Ib和低耐藥菌AAC(6′)-Ib檢出率分別為53.57%和5.00%(P＜0.01)。結論氨基苷鈍化酶和16S rRNA甲基化酶在氨基苷高耐藥鮑曼不動桿菌中檢出率高,與氨基苷類抗菌藥物高耐藥密切相關。

鮑曼不動桿菌;氨基苷鈍化酶基因;16S rRNA甲基化酶基因;重癥監護病房,急診

鮑曼不動桿菌近年來已成為常見醫院感染致病菌,因其高檢出率和高耐藥率而受到高度關注。急診重癥監護病房(emergency intensive care unit,EICU)患者分離鮑曼不動桿菌亦逐年增多,鮑曼不動桿菌已成為EICU患者感染主要致病菌之一[1]。隨著抗菌藥物廣泛應用,鮑曼不動桿菌對氨基苷類、喹諾酮類、β-內酰胺類抗菌藥物均呈現藥耐性,16S rRNA甲基化酶可使所有氨基苷類抗菌藥物失活[2]。編碼16S rRNA甲基化酶的基因主要包括rmtA、rm tB、rm tC、rm tD、rmtE、armA和npmA等7種,其中主要檢出的是armA亞型[3-4]。氨基苷類抗菌藥物耐藥主要機制為細菌產生鈍化酶[5],鈍化酶主要包括氨基苷磷酸轉移酶(aminoglycoside phosphotransferases,APH)、氨基苷核苷轉移酶(aminoglycoside nucleotidyltransferases, ANT)、氨基苷乙酰轉移酶(aminoglycoside acetyltransferases,AAC)三類,共三十余種[6]。為了分析EICU耐氨基苷鮑曼不動桿菌耐藥相關基因狀況,筆者檢測了從EICU感染患者分離鮑曼不動桿菌具有代表性的基因:16S rRNA甲基化酶armA、氨基苷核苷轉移酶ANT(3′′)-Ia、氨基苷磷酸轉移酶APH(3′)-I、氨基苷乙酰轉移酶AAC(6′)-Ib,報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月～2012年12月,EICU感染患者分離鮑曼不動桿菌48株,感染部位主要是下呼吸道和尿道,分別占57.6%和22.4%。收集1周內或住院期間反復培養出現的同部位相同菌株,不重復統計。

1.2 培養和鑒定 按《全國臨床檢驗操作規程》(2005年版)臨床微生物常規鑒定程序操作培養,用法國生物梅里埃公司VITEK系統鑒定。

1.3 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)測定 采用瓊脂對倍稀釋法測定菌株對抗菌藥物的MIC,藥敏結果判斷按2010年美國臨床和實驗室標準協會所制定的標準執行。

1.4 質控菌株 采用銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、鮑曼不動桿菌ATC19606。

1.5 儀器與試劑 試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)基因擴增儀(型號:TProfessional Trio,德國Whatman Biometra公司)

1.6 方法 以阿米卡星MIC≥256μg·m L-1為標準[7],高于該值為高耐藥菌,低于該值為低耐藥菌。氨基苷鈍化酶基因PCR擴增[8],以GenBank中基因序列設計引物,引物序列見表1,退火溫度均為55℃。上下游引物各1μL,模板液2μL,PCR預混液12.5μL,余量超輕水補足至25μL。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物,用凝膠成像系統觀察結果。

1.7 統計學方法 應用SPSS19.0版軟件進行Χ2檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥菌 高耐藥菌和低耐藥菌分別為28和20株。

2.2 氨基苷鈍化酶基因測序 經ABI自動DNA測序儀測序,與GenBank已登錄的基因序列比對,同源性為99%,16S rRNA armA、APH(3′)-I、ANT(3′′)-Ia、 AAC(6′)-Ib基因序列登錄號分別為EU140571、ACYR02000001、GU304661、EF690695。

表1 氨基苷鈍化酶基因PCR擴增引物序列Tab.1 PCR amplification primers of aminoglycoside-modifying enzymes gene

2.3 16S rRNA甲基化酶和氨基苷鈍化酶基因在高耐藥菌和低耐藥菌中檢出率比較 高耐藥菌ANT(3′′)-Ia檢出率最高,其次是16S rRNA armA,低耐藥菌未檢測到16S rRNA armA,見表2。

2.4 16S rRNA甲基化酶和氨基苷鈍化酶基因檢出情況 高耐藥菌16S rRNA armA、APH(3′)-I、ANT(3′′)-Ia、AAC(6′)-Ib 4種酶基因都檢測到的菌株數最多,共9株,見表3。低耐藥菌1株檢出APH(3′)-I、ANT(3′′)-Ia、AAC(6′)-Ib 3種鈍化酶基因,其他均未檢出。

3 討論

氨基苷類抗菌藥物耐藥鮑曼不動桿菌已經成為院內感染的主要病原菌之一,且多為高水平耐藥,其主要耐藥機制是產生鈍化酶[3],以及新近發現的產生16S rRNA甲基化酶[2]等。不同的鈍化酶有相對應的特異性作用底物,通常介導一種或幾種相似結構的氨基苷類抗菌藥物產生耐藥性[9],16S rRNA甲基化酶由質粒介導。

表2 16S rRNA甲基化酶和氨基苷鈍化酶基因在高耐藥菌和低耐藥菌中檢出率Tab.2 Detection rate of am inoglycoside-mod ifying enzym es gene and 16S rRNA methylase gene in high resistant and low resistant Acinetobacter baumannii

氨基苷類抗菌藥物MIC為256μg·mL-1時具有陽性預測意義[7]。本研究以阿米卡星MIC≥256μg·mL-1的菌株為高耐藥菌株,MIC＜256μg·mL-1的菌株為低耐藥菌株。分離的48株鮑曼不動桿菌中, 28株為高耐藥菌株,20株為低耐藥菌株。

表3 高耐藥菌中16S rRNA arm A、APH(3′)-I、ANT (3′′)-Ia、AAC(6′)-Ib 4種酶基因檢出情況Tab.3 Detection on 16S rRNA arm A、APH(3′)-I、ANT (3′′)-Ia、AAC(6′)-Ib gene in highly resistan t Acinetobacter baumannii

本實驗結果顯示,EICU患者中分離的鮑曼不動桿菌高耐藥株攜帶16S rRNA armA基因陽性率較高,氨基苷鈍化酶基因核苷轉移酶ANT(3′′)-Ia、磷酸轉移酶APH(3′)-I、乙酰轉移酶AAC(6′)-Ib陽性率依次降低。不同地區鈍化酶差異較大,美國以ANT(2′′)最常見,日本以AAC(6′)常見,可能與不同地區抗菌藥物應用差異較大有關。

同時檢出3種鈍化酶基因的菌株,對氨基苷類抗菌藥物均呈現高度耐藥,原因應為3種基因表達產物作用底物覆蓋了所有氨基苷類抗菌藥物；而僅檢出一種或兩種鈍化酶基因的菌株,對不同氨基苷類抗菌藥物中有些品種存在低耐藥或敏感菌株,其機制應與只介導一種或幾種相似結構的氨基苷類抗菌藥物有關[9],如APH(3′)-I對卡那霉素、核糖霉素、新霉素等產生耐藥性,ANT(3′′)-I對鏈霉素、大觀霉素等產生耐藥性,AAC(6′)-I對阿米卡星、奈替米星、妥布霉素等產生耐藥性。16S rRNA甲基化酶的出現給原有氨基苷類抗菌藥物針對拮抗鈍化酶進行結構改造的研發思路帶來很大的障礙。

本研究顯示,氨基苷類抗菌藥物高耐藥鮑曼不動桿菌耐藥與氨基苷鈍化酶和16S rRNA甲基化酶基因表達有關,與DOI等[2]報道一致。1株未檢出氨基苷鈍化酶基因菌株呈現高耐藥,1株檢出3種鈍化酶基因菌株呈現低耐藥,說明鮑曼不動桿菌耐藥機制復雜,存在其他耐藥機制,如:核糖體結合位點改變、外排泵過度表達、外膜孔蛋白表達缺失等,具體耐藥機制有待進一步研究。

總之,及時發現耐藥菌株及流行趨勢,可有效延緩細菌產生耐藥性,控制耐藥菌傳播,為臨床合理選用抗菌藥物提供依據。

[1] 趙雪,于沛濤,王弋,等.急診重癥監護病房病原學調查及臨床分析[J].北京醫學,2013,35(3):178-181.

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.008

Drug Resistance Mechanism of Patients Infected with Aminoglycoside-resistant Acinetobacter Baumannii in Emergency Intensive Care Unit

ZHAO Xue1,YU Pei-tao2,XU Zhi-jun1,GU Qing1,QIU Li-feng1,WANG Yi1
(1.Department of Emergency,the First Poeple's Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310003,China;2.School of Basic Medicine,Peking University, Beijing 100191,China)

ObjectiveTo investigate drug resistance mechanism of am inoglycoside-resistant Acinetobacter baumannii by detecting 16S rRNA methylase gene and three common genes of aminoglycoside-modifying enzymes in Acinetobacter baumannii infected patients at EICU.MethodsThe 48 Acinetobacter baumannii strains were collected,and antimicrobial susceptibility tests were performed by VITEK automicroscan.The MIC was detected by 2-fold agar dilutionmethod,and genes were analyzed by polymerase chain reaction(PCR).ResultsAmong48 strains,28 werehighly resistant to aminoglycosides and 20 showed lower resistances.The 16S rRNA armA,APH(3')-I,ANT(3'')-Ia,AAC(6')-Ib geneswere detected in 71.43%,60.71%,82.14%, and 53.57%of the 28 highly resistant strains,but only present in 0.00%,5.00%,5.00%,and 5.00%of the low-resistant isolates(P＜0.01).ConclusionThe aminoglycoside-modifying enzymes and 16S rRNA methylase were frequently found in Acinetobacter baumannii clinical isolates,which is closely related to the high-level resistance to aminoglycoside antibiotics.

Acinetobacter baumannii;Aminoglycoside-passivating enzymes genes;16S rRNA methylase gene; Intensive care unit,emergency

R978.12;R969.3

A

1004-0781(2014)05-0579-03

2013-07-05

2013-09-06

趙雪(1978-),男,浙江杭州人,主治醫師,在讀碩士,從事急診醫學研究。電話:(0)13750888506,E-mail:15130726@qq.com。

于沛濤(1969-),男,北京人,副教授,學士,從事基礎醫學研究。電話:(0)13701096687,E-mail:yupeitao@126.com。