鈣黏蛋白表達與表皮生長因子受體分子靶向治療敏感/耐藥的相關性

邢榮春,鄭軍,劉偉,姚汝鋮

(三峽大學第一臨床醫學院、湖北省宜昌市中心人民醫院普通外科,宜昌 443003)

鈣黏蛋白表達與表皮生長因子受體分子靶向治療敏感/耐藥的相關性

邢榮春,鄭軍,劉偉,姚汝鋮

(三峽大學第一臨床醫學院、湖北省宜昌市中心人民醫院普通外科,宜昌 443003)

目的 探討鈣黏蛋白表達與表皮生長因子受體(EGFR)分子靶向治療敏感或耐藥的相關性。方法乳腺癌細胞(MCF-7和MDA-MB-231)、膀胱癌細胞株(T24)、子宮頸鱗癌細胞(SiHa)、大細胞肺癌細胞株(H460)、肝癌細胞株(SK-HEP-1和MHCC97-H)以及單核細胞白血病(THP-1)等8種細胞分別用表皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制藥(EGFR-TKI)PD153035和吉非替尼處理48 h,采用噻唑藍(MTT)法檢測其敏感或耐藥性,計算各細胞的半數抑制濃度(IC50),并與各細胞鈣黏蛋白水平比較,觀察相關性。結果隨著PD153035和吉非替尼濃度的升高,MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa細胞生存率明顯下降,表現為敏感,鈣黏蛋白表達陽性;H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1細胞生存率未見明顯下降,表現為耐藥,鈣黏蛋白表達陰性。結論EGFR-TKI對上皮性腫瘤細胞的生存率與鈣黏蛋白的表達水平存在相關性;鈣黏蛋白可能在調節EGFR分子靶向治療的敏感性方面起重要作用;鈣黏蛋白作為標志物為臨床篩選合適的患者進行EGFR-TKI分子靶向治療提供了重要線索。

鈣黏蛋白;表皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制藥;耐藥;靶向治療

隨著對惡性腫瘤基礎研究的不斷深入,針對癌細胞異常通路和靶點的分子藥物有著廣闊的應用前景。目前,針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)分子靶向治療已廣泛應用于各類腫瘤的治療,相對于傳統化學治療藥物其已顯現出獨特的優勢。在腫瘤的發生發展過程中,一個共同的分子過程是EGFR高表達或突變以后的異?；钴S,不斷將表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)刺激的信號傳入細胞內,導致細胞無限制增殖和癌變,最終發生局部浸潤和遠處轉移。研究發現,腫瘤患者EGFR的過高表達與腫瘤的惡性程度、浸潤轉移情況、不良預后均有密切關系,是一個重要的分子靶點[1-2]。鈣黏蛋白(E-cadherin)不僅參與了腫瘤組織浸潤和轉移,而且與EGFR分子靶向治療敏感/耐藥性關系密切,筆者主要探討鈣黏蛋白與EGFR分子靶向治療敏感/耐藥的相關性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 本實驗中乳腺癌細胞株(MCF-7和MDA-MB-231)、膀胱癌細胞株(T24)、子宮頸鱗癌細胞株(SiHa)、大細胞肺癌細胞株(H460)、肝癌細胞株(SKHEP-1和MHCC97-H)以及白血病單核細胞株(THP-1)等8種細胞均由三峽大學醫學院分子生物學研究所惠贈。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 實驗儀器 二氧化碳(CO2)恒溫培養箱(MCO175175C型,日本SANYO公司)；倒置生物顯微鏡(XS2-D2型,重慶光學儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(DK-S26型,上海精宏實驗設備有限公司)；超凈工作臺(SW-CQ-IF型,上海玻璃儀器一廠)；自動平衡離心機(LDZ5-2型,北京醫用離心機廠)；超低溫冰箱(ELT-13V型,美國LANIS公司)；負壓玻璃濾器(Germany公司)。

1.2.2 實驗試劑 RPMI-1640培養液(GIBCO公司)；青霉素(華北制藥股份有限公司)；鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；小牛血清(杭州四季青生物技術有限公司)；鈣黏蛋白一抗鼠抗人單克隆抗體(Cell Sling公司)；鈣黏蛋白二抗為羊抗鼠RAP抗體(武漢谷歌科技有限公司)；β-actin一抗為兔抗人抗體(武漢谷歌科技有限公司)；β-actin二抗為羊抗兔RAP抗體(武漢谷歌科技有限公司)；BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒(碧云天生物有限公司)；噻唑藍(thiazolyl blue,MTT)試劑(武漢谷歌科技有限公司)；PD153035、吉非替尼(南京德寶生化器材有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT實驗方法 檢測細胞增殖抑制率時在96孔培養板上進行。制備單細胞懸液,調整細胞濃度至2× 105·mL-1。細胞懸液100μL加入96孔培養板,即每孔加2×104細胞,每組6孔。過夜后,翻板倒凈培養液,加含不同濃度藥物的培養液處理細胞,再將培養板放入CO2培養箱繼續培養48 h。然后每孔加入MTT 20μL,于37℃培養2 h。翻板倒掉上清液,加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液100μL溶解。分光光度計測定吸光度(A值,波長570 nm)。細胞增殖生存率(%)=(實驗組A值-本底A值)/對照組A值×100%。

1.3.2 Western-blot實驗方法 提取蛋白并定量樣本,將等量的蛋白樣品(50μg)加入聚丙烯酰胺凝膠,常規電泳、轉膜。用含5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)封閉硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜),室溫60 min。加入1∶1 000稀釋的一抗在4℃搖床上過夜。PBS洗4次。加入1∶5 000的二抗搖床上室溫60 min。PBS洗4次。最后加入電化學發光底物反應5 min,暗室顯影,β-actin為內參。

1.3.3 統計學方法 所有數據均用Excel表及SPSS13.0版軟件包處理,然后進行統學分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 8種細胞經PD153035處理后的生存率 其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa細胞生存率隨PD153035濃度升高而降低,表現為敏感；H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1細胞生存率隨PD153035濃度升高而未見明顯降低,表現為耐藥。見圖1。

圖1 8種細胞經PD153035處理后的生存曲線Fig.1 Survival curve of eight kinds of cells treated by PD153035

2.2 8種細胞經吉非替尼處理后的生存率 其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa細胞生存率隨吉非替尼濃度升高而降低,表現為敏感；H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1細胞生存率隨吉非替尼濃度升高而未見明顯降低,表現為耐藥。見圖2。

圖2 8種細胞經吉非替尼處理后的生存曲線Fig.2 Survival curve of eight kinds of cells treated by gefitinib

2.3 PD153035和吉非替尼分別對8種細胞的IC50值分別比較上皮細胞與間質細胞的IC50,發現PD153035作用于MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa細胞的IC50值與作用于H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1的IC50值差異有統計學意義(P＜0.05)；吉非替尼作用于MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa細胞的IC50值與作用于H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1的IC50值之間差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 PD153035和吉非替尼分別對8種細胞的IC50值Tab.1 IC50of PD153035 and gefitinib on eight kinds of cells μmol·L-1

2.4 Western-blot結果 Western-blot檢測結果顯示: MCF-7、MDA-MB-231、T24、SiHa細胞中鈣黏蛋白表達陽性；而H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1細胞中蛋白表達陰性。見圖3。

圖3 8種細胞的W estern-blot檢測結果Fig.3 Western-blot test results of eight kinds of cells

3 討論

鈣黏蛋白分布于人和動物的各類上皮細胞,在維持細胞的極性和完整性等方面起重要作用。鈣黏蛋白的胞內部分高度保守,與連環素形成復合物,連接于肌動蛋白細胞骨架,由此得以形成和維持細胞與細胞的穩固連接和正常的組織結構[3]。鈣黏蛋白是促進上皮細胞間相互黏附和維持組織結構穩定的重要蛋白,其表達受遺傳控制、信號通路、鋅指蛋白家族及miRNAs等的調節[4]。鈣黏蛋白在介導細胞內信號轉導和募集免疫應答細胞過程中起重要作用,其表達與腫瘤EGFR的分子靶向治療敏感/耐藥性關系密切。鈣黏蛋白參與細胞間復雜的調控可能參與了EGFR-酪胺酸激酶抑制藥(throsine kinase inhibitors,TKI)敏感或耐藥的形成。筆者采用MTT測定EGFR-TKI (PD153035、吉非替尼)對細胞MCF-7、MDA-MB-231、T24、SiHa、H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1生存率的影響,其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa隨藥物濃度的升高細胞生存率下降明顯,表現為敏感, H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1隨藥物濃度的升高細胞生存率未見明顯下降,表現為耐藥。

細胞上皮-間質轉變(epithelial mesenchymal transition,EMT)是腫瘤組織浸潤和轉移的重要機制之一,其最重要的特征是上皮型鈣黏蛋白表達的丟失,與本研究中上皮性癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa中鈣黏蛋白表達陽性；而間質性腫瘤細胞H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1蛋白表達陰性的結果一致。鈣黏蛋白表達下降或缺失,不僅與腫瘤的發生發展相關,而且還與腫瘤細胞的低分化、高侵襲性和轉移性相關,同時還直接影響著患者的預后。鈣黏蛋白主要功能是介導同型細胞間的黏附,因而參與胚胎發育、正常組織上皮細胞層的形成及維持其完整性和極性,具有抑制腫瘤細胞轉移和侵襲的作用。

本研究顯示PD153035和吉非替尼作用于癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa,隨藥物濃度的升高細胞生存率下降明顯,表現為敏感,鈣黏蛋白表達陽性；癌細胞H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1隨藥物濃度的升高細胞生存率未見降明顯下降,表現為耐藥,鈣黏蛋白表達陰性。說明鈣黏蛋白表達與EGFR-TKI治療腫瘤敏感/耐藥性存在明顯的相關性,并可能在其中發揮了重要作用。鈣黏蛋白作為標志物為臨床篩選合適的患者進行EGFR-TKI分子靶向治療提供了重要線索。

EGFR和鈣黏蛋白發生相互作用的空間基礎是兩者的亞細胞定位非常鄰近,EGFR和鈣黏蛋白共同存在于細胞間的黏附小帶區。近年來,一些研究發現兩者存在雙向的作用關系[5]:在EGFR調節鈣黏蛋白方面,鈣黏蛋白的細胞質內區與β-連環蛋白(β-catenin)的核心區連接成復合物,再連接到肌動蛋白的細胞骨架上,以維持細胞間的緊密連接。β-catenin是EGFR作用的底物,當EGFR配體(如EGF、TGF-β等)與EGFR結合后,具有酪胺酸激酶活性的EGFR細胞質內區活化,引起鈣黏蛋白與βcatenin復合物中的β-catenin磷酸化,導致β-catenin從復合體解離并使復合物從肌動蛋白解離開來,從而降低細胞間的黏附性。因此,配體與EGFR受體的結合能促使鈣黏蛋白表達的下調和EMT的發生[6]。

鈣黏蛋白是一個鈣依賴的細胞膜表面黏附分子,當細胞環境從低鈣向高鈣環境變化時能激活鈣黏蛋白的活化及EGFR的磷酸化[7-8]。此外,鈣黏蛋白通過其細胞外的結構域和EGFR結合,還將減少后者的活性及與EGF結合的親和力[9]。

研究發現,在鈣黏蛋白突變的情況下,EGFR的磷酸化和受體內化顯著增強[10]。但研究未提及鈣黏蛋白的正常功能、缺少或突變對EGFR靶向治療敏感性的影響。在EGF等生長因子的刺激下,EGFR受體內化的速度加快,同時也激活EGFR某些區域從而加速某些蛋白的降解。這些可能是機體內一種控制EGF信號強弱和持續性的機制,鈣黏蛋白與EGFR互相調控的具體信號通路有待進一步研究。

[1] SAIF M W.Colorectal cancer in review:the role of the EGFR pathway[J].Exp Opin Investig Drugs,2010,19 (3):357-369.

[2] FRATTOM E,SANTINID,VINCERNZIB,et al.Targeting EGFR in bilio-pancreatic and liver carcinoma[J].Front Biosci(Schol Ed),2011,3:16-22.

[3] TUNGGAL J A,HELFRICH I,SCHMITZ A,et al.E-cadherin is essential forin vivoepidermal barrier function by regulating tight junctions[J].EMBO J,2005,24(6): 1146-1156.

[4] BARANWAL S,ALAHARI S K.Molecular mechanisms controlling E-cadherin expression in breast cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,384(1):6-11.

[5] ANDL C D,RUSTGI A K.No one-way street:cross-talk between E-cadherin and receptor tyrosine kinase(RTK) signaling:a mechanism to regulate RTK activity[J]. Cancer Biol Ther,2005,4(1):28-31.

[6] YASMEEN A,BISMAR T A,ALMOUSTAFA A E.ErbB receptors and epithelial-cadherin-catenin complex in human carcinomas[J].Future Oncol,2006,2(6):765-781.

[7] PECE S,GUTKIND JS.Signaling from E-cadherins to the MAPK pathway by the recruitment and activation of epidermal growth factor receptors upon cell-cell contact formation[J].JBiol Chem,2000,275(52):41227-41233.

[8] HEIJINK IH,KIES P M,KAUFFMAN H F,et al.Downregulation of E-cadherin in human bronchial epithelial cells leads to epidermal growth factor receptor-dependent Th2 cell-promoting activity[J].J Immunol,2007,178(12): 7678-7685.

[9] QIAN X,KARPOVA T,SHEPPARD AM,etal.E-cadherinmediated adhesion inhibits ligand-dependent activation of diverse receptor tyrosine kinases[J].EMBO J,2004,23 (8):1739-1748.

[10] BREMM A,WALCH A,FUCHS M,et al.Enhanced activation of epidermal growth factor receptor caused by tumor-derived E-cadherin mutations[J].Cancer Res, 2008,68(3):707-714.

DOI 10.3870/yydb.2014.05.009

Correlation of E-cadherin Expression and the Sensitivity to EGFR-TKI Molecular Targeted Therapy

XING Rong-chun,ZHENG Jun,LIU Wei,YAO Ru-cheng
(Department of General Surgery,the First Clinical Medicine College,Three Gorges University,Yichang 443003,China)

ObjectiveTo explore the correlation of E-cadherin expression and the sensitivity to EGFR-TKImolecular targeted therapy.MethodsEight kinds of cells,MCF-7,MDA-MB-231,T24,SiHa,H460,SK-HEP-1,MHCC97-H and THP-1 were treated with EGFR-TKIPD153035 and gefitinib,respectively,for 48 hours.The drug-sensitivity was detected by MTT,and theIC50of cellswere calculated.The E-cadherin protein were detected and compared.ResultsFollowed with PD153035 and gefitinib treatment,the survival rates of MCF-7,MDA-MB-231,T24 and SiHa significantly reduced,and more E-cadherin protein expressed.However,the survival rates of the H460,SK-HEP-1,MHCC97-H,and THP-1 cells showed opposite results.ConclusionThe sensitivity of epithelial cancer cells to EGFR-TKI is correlated with E-cadherin expression.E-cadherin may play a significant role on regulateing the sensitivity to EGFR-TKImolecular targeted therapy.E-cadherin is a key biomarker for recruiting appropriate patients for EGFR-TKImolecular targeted therapy.

E-cadherin;Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors;Resistance;Targeted therapy

R979.1;R965.1

A

1004-0781(2014)05-0582-04

2013-05-27

2013-10-10

邢榮春(1985-),男,湖北黃岡人,住院醫師,碩士,專業方向:主要從事普通外科腫瘤研究。電話:(0) 13469870373,E-mail:xingrongchun@sina.com。

鄭軍(1965-),男,湖北宜昌人,主任醫師,教授,研究方向:主要從事普通外科腫瘤研究。電話:(0) 15871598533,E-mail:zhengjun1995@163.com。