鈣黏蛋白表達(dá)與表皮生長因子受體分子靶向治療敏感/耐藥的相關(guān)性

邢榮春,鄭軍,劉偉,姚汝鋮

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院、湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院普通外科,宜昌 443003)

鈣黏蛋白表達(dá)與表皮生長因子受體分子靶向治療敏感/耐藥的相關(guān)性

邢榮春,鄭軍,劉偉,姚汝鋮

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院、湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院普通外科,宜昌 443003)

目的 探討鈣黏蛋白表達(dá)與表皮生長因子受體(EGFR)分子靶向治療敏感或耐藥的相關(guān)性。方法乳腺癌細(xì)胞(MCF-7和MDA-MB-231)、膀胱癌細(xì)胞株(T24)、子宮頸鱗癌細(xì)胞(SiHa)、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(H460)、肝癌細(xì)胞株(SK-HEP-1和MHCC97-H)以及單核細(xì)胞白血病(THP-1)等8種細(xì)胞分別用表皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制藥(EGFR-TKI)PD153035和吉非替尼處理48 h,采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)其敏感或耐藥性,計(jì)算各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50),并與各細(xì)胞鈣黏蛋白水平比較,觀察相關(guān)性。結(jié)果隨著PD153035和吉非替尼濃度的升高,MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa細(xì)胞生存率明顯下降,表現(xiàn)為敏感,鈣黏蛋白表達(dá)陽性;H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1細(xì)胞生存率未見明顯下降,表現(xiàn)為耐藥,鈣黏蛋白表達(dá)陰性。結(jié)論EGFR-TKI對(duì)上皮性腫瘤細(xì)胞的生存率與鈣黏蛋白的表達(dá)水平存在相關(guān)性;鈣黏蛋白可能在調(diào)節(jié)EGFR分子靶向治療的敏感性方面起重要作用;鈣黏蛋白作為標(biāo)志物為臨床篩選合適的患者進(jìn)行EGFR-TKI分子靶向治療提供了重要線索。

鈣黏蛋白;表皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制藥;耐藥;靶向治療

隨著對(duì)惡性腫瘤基礎(chǔ)研究的不斷深入,針對(duì)癌細(xì)胞異常通路和靶點(diǎn)的分子藥物有著廣闊的應(yīng)用前景。目前,針對(duì)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)分子靶向治療已廣泛應(yīng)用于各類腫瘤的治療,相對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物其已顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,一個(gè)共同的分子過程是EGFR高表達(dá)或突變以后的異常活躍,不斷將表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)刺激的信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞無限制增殖和癌變,最終發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者EGFR的過高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、浸潤轉(zhuǎn)移情況、不良預(yù)后均有密切關(guān)系,是一個(gè)重要的分子靶點(diǎn)[1-2]。鈣黏蛋白(E-cadherin)不僅參與了腫瘤組織浸潤和轉(zhuǎn)移,而且與EGFR分子靶向治療敏感/耐藥性關(guān)系密切,筆者主要探討鈣黏蛋白與EGFR分子靶向治療敏感/耐藥的相關(guān)性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 本實(shí)驗(yàn)中乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7和MDA-MB-231)、膀胱癌細(xì)胞株(T24)、子宮頸鱗癌細(xì)胞株(SiHa)、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(H460)、肝癌細(xì)胞株(SKHEP-1和MHCC97-H)以及白血病單核細(xì)胞株(THP-1)等8種細(xì)胞均由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究所惠贈(zèng)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(MCO175175C型,日本SANYO公司)；倒置生物顯微鏡(XS2-D2型,重慶光學(xué)儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(DK-S26型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(tái)(SW-CQ-IF型,上海玻璃儀器一廠)；自動(dòng)平衡離心機(jī)(LDZ5-2型,北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；超低溫冰箱(ELT-13V型,美國LANIS公司)；負(fù)壓玻璃濾器(Germany公司)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBCO公司)；青霉素(華北制藥股份有限公司)；鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；小牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司)；鈣黏蛋白一抗鼠抗人單克隆抗體(Cell Sling公司)；鈣黏蛋白二抗為羊抗鼠RAP抗體(武漢谷歌科技有限公司)；β-actin一抗為兔抗人抗體(武漢谷歌科技有限公司)；β-actin二抗為羊抗兔RAP抗體(武漢谷歌科技有限公司)；BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒(碧云天生物有限公司)；噻唑藍(lán)(thiazolyl blue,MTT)試劑(武漢谷歌科技有限公司)；PD153035、吉非替尼(南京德寶生化器材有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT實(shí)驗(yàn)方法 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率時(shí)在96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行。制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至2× 105·mL-1。細(xì)胞懸液100μL加入96孔培養(yǎng)板,即每孔加2×104細(xì)胞,每組6孔。過夜后,翻板倒凈培養(yǎng)液,加含不同濃度藥物的培養(yǎng)液處理細(xì)胞,再將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后每孔加入MTT 20μL,于37℃培養(yǎng)2 h。翻板倒掉上清液,加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液100μL溶解。分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(A值,波長570 nm)。細(xì)胞增殖生存率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-本底A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.3.2 Western-blot實(shí)驗(yàn)方法 提取蛋白并定量樣本,將等量的蛋白樣品(50μg)加入聚丙烯酰胺凝膠,常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)封閉硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜),室溫60 min。加入1∶1 000稀釋的一抗在4℃搖床上過夜。PBS洗4次。加入1∶5 000的二抗搖床上室溫60 min。PBS洗4次。最后加入電化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)5 min,暗室顯影,β-actin為內(nèi)參。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用Excel表及SPSS13.0版軟件包處理,然后進(jìn)行統(tǒng)學(xué)分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 8種細(xì)胞經(jīng)PD153035處理后的生存率 其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa細(xì)胞生存率隨PD153035濃度升高而降低,表現(xiàn)為敏感；H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1細(xì)胞生存率隨PD153035濃度升高而未見明顯降低,表現(xiàn)為耐藥。見圖1。

圖1 8種細(xì)胞經(jīng)PD153035處理后的生存曲線Fig.1 Survival curve of eight kinds of cells treated by PD153035

2.2 8種細(xì)胞經(jīng)吉非替尼處理后的生存率 其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa細(xì)胞生存率隨吉非替尼濃度升高而降低,表現(xiàn)為敏感；H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1細(xì)胞生存率隨吉非替尼濃度升高而未見明顯降低,表現(xiàn)為耐藥。見圖2。

圖2 8種細(xì)胞經(jīng)吉非替尼處理后的生存曲線Fig.2 Survival curve of eight kinds of cells treated by gefitinib

2.3 PD153035和吉非替尼分別對(duì)8種細(xì)胞的IC50值分別比較上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的IC50,發(fā)現(xiàn)PD153035作用于MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa細(xì)胞的IC50值與作用于H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1的IC50值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；吉非替尼作用于MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa細(xì)胞的IC50值與作用于H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1的IC50值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 PD153035和吉非替尼分別對(duì)8種細(xì)胞的IC50值Tab.1 IC50of PD153035 and gefitinib on eight kinds of cells μmol·L-1

2.4 Western-blot結(jié)果 Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示: MCF-7、MDA-MB-231、T24、SiHa細(xì)胞中鈣黏蛋白表達(dá)陽性；而H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1細(xì)胞中蛋白表達(dá)陰性。見圖3。

圖3 8種細(xì)胞的W estern-blot檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Western-blot test results of eight kinds of cells

3 討論

鈣黏蛋白分布于人和動(dòng)物的各類上皮細(xì)胞,在維持細(xì)胞的極性和完整性等方面起重要作用。鈣黏蛋白的胞內(nèi)部分高度保守,與連環(huán)素形成復(fù)合物,連接于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架,由此得以形成和維持細(xì)胞與細(xì)胞的穩(wěn)固連接和正常的組織結(jié)構(gòu)[3]。鈣黏蛋白是促進(jìn)上皮細(xì)胞間相互黏附和維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要蛋白,其表達(dá)受遺傳控制、信號(hào)通路、鋅指蛋白家族及miRNAs等的調(diào)節(jié)[4]。鈣黏蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和募集免疫應(yīng)答細(xì)胞過程中起重要作用,其表達(dá)與腫瘤EGFR的分子靶向治療敏感/耐藥性關(guān)系密切。鈣黏蛋白參與細(xì)胞間復(fù)雜的調(diào)控可能參與了EGFR-酪胺酸激酶抑制藥(throsine kinase inhibitors,TKI)敏感或耐藥的形成。筆者采用MTT測(cè)定EGFR-TKI (PD153035、吉非替尼)對(duì)細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、T24、SiHa、H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1生存率的影響,其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa隨藥物濃度的升高細(xì)胞生存率下降明顯,表現(xiàn)為敏感, H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1隨藥物濃度的升高細(xì)胞生存率未見明顯下降,表現(xiàn)為耐藥。

細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial mesenchymal transition,EMT)是腫瘤組織浸潤和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一,其最重要的特征是上皮型鈣黏蛋白表達(dá)的丟失,與本研究中上皮性癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa中鈣黏蛋白表達(dá)陽性；而間質(zhì)性腫瘤細(xì)胞H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1蛋白表達(dá)陰性的結(jié)果一致。鈣黏蛋白表達(dá)下降或缺失,不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),而且還與腫瘤細(xì)胞的低分化、高侵襲性和轉(zhuǎn)移性相關(guān),同時(shí)還直接影響著患者的預(yù)后。鈣黏蛋白主要功能是介導(dǎo)同型細(xì)胞間的黏附,因而參與胚胎發(fā)育、正常組織上皮細(xì)胞層的形成及維持其完整性和極性,具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的作用。

本研究顯示PD153035和吉非替尼作用于癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa,隨藥物濃度的升高細(xì)胞生存率下降明顯,表現(xiàn)為敏感,鈣黏蛋白表達(dá)陽性；癌細(xì)胞H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1隨藥物濃度的升高細(xì)胞生存率未見降明顯下降,表現(xiàn)為耐藥,鈣黏蛋白表達(dá)陰性。說明鈣黏蛋白表達(dá)與EGFR-TKI治療腫瘤敏感/耐藥性存在明顯的相關(guān)性,并可能在其中發(fā)揮了重要作用。鈣黏蛋白作為標(biāo)志物為臨床篩選合適的患者進(jìn)行EGFR-TKI分子靶向治療提供了重要線索。

EGFR和鈣黏蛋白發(fā)生相互作用的空間基礎(chǔ)是兩者的亞細(xì)胞定位非常鄰近,EGFR和鈣黏蛋白共同存在于細(xì)胞間的黏附小帶區(qū)。近年來,一些研究發(fā)現(xiàn)兩者存在雙向的作用關(guān)系[5]:在EGFR調(diào)節(jié)鈣黏蛋白方面,鈣黏蛋白的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)與β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的核心區(qū)連接成復(fù)合物,再連接到肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架上,以維持細(xì)胞間的緊密連接。β-catenin是EGFR作用的底物,當(dāng)EGFR配體(如EGF、TGF-β等)與EGFR結(jié)合后,具有酪胺酸激酶活性的EGFR細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)活化,引起鈣黏蛋白與βcatenin復(fù)合物中的β-catenin磷酸化,導(dǎo)致β-catenin從復(fù)合體解離并使復(fù)合物從肌動(dòng)蛋白解離開來,從而降低細(xì)胞間的黏附性。因此,配體與EGFR受體的結(jié)合能促使鈣黏蛋白表達(dá)的下調(diào)和EMT的發(fā)生[6]。

鈣黏蛋白是一個(gè)鈣依賴的細(xì)胞膜表面黏附分子,當(dāng)細(xì)胞環(huán)境從低鈣向高鈣環(huán)境變化時(shí)能激活鈣黏蛋白的活化及EGFR的磷酸化[7-8]。此外,鈣黏蛋白通過其細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域和EGFR結(jié)合,還將減少后者的活性及與EGF結(jié)合的親和力[9]。

研究發(fā)現(xiàn),在鈣黏蛋白突變的情況下,EGFR的磷酸化和受體內(nèi)化顯著增強(qiáng)[10]。但研究未提及鈣黏蛋白的正常功能、缺少或突變對(duì)EGFR靶向治療敏感性的影響。在EGF等生長因子的刺激下,EGFR受體內(nèi)化的速度加快,同時(shí)也激活EGFR某些區(qū)域從而加速某些蛋白的降解。這些可能是機(jī)體內(nèi)一種控制EGF信號(hào)強(qiáng)弱和持續(xù)性的機(jī)制,鈣黏蛋白與EGFR互相調(diào)控的具體信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。

[1] SAIF M W.Colorectal cancer in review:the role of the EGFR pathway[J].Exp Opin Investig Drugs,2010,19 (3):357-369.

[2] FRATTOM E,SANTINID,VINCERNZIB,et al.Targeting EGFR in bilio-pancreatic and liver carcinoma[J].Front Biosci(Schol Ed),2011,3:16-22.

[3] TUNGGAL J A,HELFRICH I,SCHMITZ A,et al.E-cadherin is essential forin vivoepidermal barrier function by regulating tight junctions[J].EMBO J,2005,24(6): 1146-1156.

[4] BARANWAL S,ALAHARI S K.Molecular mechanisms controlling E-cadherin expression in breast cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,384(1):6-11.

[5] ANDL C D,RUSTGI A K.No one-way street:cross-talk between E-cadherin and receptor tyrosine kinase(RTK) signaling:a mechanism to regulate RTK activity[J]. Cancer Biol Ther,2005,4(1):28-31.

[6] YASMEEN A,BISMAR T A,ALMOUSTAFA A E.ErbB receptors and epithelial-cadherin-catenin complex in human carcinomas[J].Future Oncol,2006,2(6):765-781.

[7] PECE S,GUTKIND JS.Signaling from E-cadherins to the MAPK pathway by the recruitment and activation of epidermal growth factor receptors upon cell-cell contact formation[J].JBiol Chem,2000,275(52):41227-41233.

[8] HEIJINK IH,KIES P M,KAUFFMAN H F,et al.Downregulation of E-cadherin in human bronchial epithelial cells leads to epidermal growth factor receptor-dependent Th2 cell-promoting activity[J].J Immunol,2007,178(12): 7678-7685.

[9] QIAN X,KARPOVA T,SHEPPARD AM,etal.E-cadherinmediated adhesion inhibits ligand-dependent activation of diverse receptor tyrosine kinases[J].EMBO J,2004,23 (8):1739-1748.

[10] BREMM A,WALCH A,FUCHS M,et al.Enhanced activation of epidermal growth factor receptor caused by tumor-derived E-cadherin mutations[J].Cancer Res, 2008,68(3):707-714.

DOI 10.3870/yydb.2014.05.009

Correlation of E-cadherin Expression and the Sensitivity to EGFR-TKI Molecular Targeted Therapy

XING Rong-chun,ZHENG Jun,LIU Wei,YAO Ru-cheng
(Department of General Surgery,the First Clinical Medicine College,Three Gorges University,Yichang 443003,China)

ObjectiveTo explore the correlation of E-cadherin expression and the sensitivity to EGFR-TKImolecular targeted therapy.MethodsEight kinds of cells,MCF-7,MDA-MB-231,T24,SiHa,H460,SK-HEP-1,MHCC97-H and THP-1 were treated with EGFR-TKIPD153035 and gefitinib,respectively,for 48 hours.The drug-sensitivity was detected by MTT,and theIC50of cellswere calculated.The E-cadherin protein were detected and compared.ResultsFollowed with PD153035 and gefitinib treatment,the survival rates of MCF-7,MDA-MB-231,T24 and SiHa significantly reduced,and more E-cadherin protein expressed.However,the survival rates of the H460,SK-HEP-1,MHCC97-H,and THP-1 cells showed opposite results.ConclusionThe sensitivity of epithelial cancer cells to EGFR-TKI is correlated with E-cadherin expression.E-cadherin may play a significant role on regulateing the sensitivity to EGFR-TKImolecular targeted therapy.E-cadherin is a key biomarker for recruiting appropriate patients for EGFR-TKImolecular targeted therapy.

E-cadherin;Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors;Resistance;Targeted therapy

R979.1;R965.1

A

1004-0781(2014)05-0582-04

2013-05-27

2013-10-10

邢榮春(1985-),男,湖北黃岡人,住院醫(yī)師,碩士,專業(yè)方向:主要從事普通外科腫瘤研究。電話:(0) 13469870373,E-mail:xingrongchun@sina.com。

鄭軍(1965-),男,湖北宜昌人,主任醫(yī)師,教授,研究方向:主要從事普通外科腫瘤研究。電話:(0) 15871598533,E-mail:zhengjun1995@163.com。