神經生長因子對H9c2心肌細胞缺氧／復氧后凋亡的保護作用及其機制

謝 飛，魏 珂，閔 蘇，郝學超，朱賢林

神經營養因子（neurotrophins，NTs）除對神經系統中神經元的分化、發育以及維持其正常生理功能等有重要作用外，其對心血管系統也有明顯的調控作用［1］。作為NTs家族中最早發現的調控因子，神經生長因子（nerve growth factor，NGF）及其特異性受體TrkA首先由Nemoto等［2］在大鼠主動脈平滑肌中檢測出表達。PI3k-Akt通路做為神經元存活的主要途徑之一，具有調控胞內物質代謝、基因表達、細胞繁殖等多種生物學功能，并且參與細胞對抗化學性缺氧損傷［3］。NGF可在發育期和成熟的心肌細胞中合成和分泌，與TrkA結合后引起PI3k-Akt通路的激活和核／胞質穿梭、繼而激活轉錄因子Foxo-3a和Foxo-1，出核發揮相應作用［4］。近年一項研究發現，局部的NGF基因轉移能促進細胞修復，維持大鼠在體心肌梗死細胞的存活，從而減輕凋亡［5］，而PI3k受體被其阻斷劑LY294002阻斷后，這種保護作用減弱［6］。既往研究認為NGF對抗心肌缺血／再灌注損傷的效應可能是通過其對心臟交感神經的功能保護而產生的，而在新生和成年大鼠心肌細胞的缺氧／復氧（H／R）或血管緊張素Ⅱ（ANGⅡ）處理模型上，以基因轉移或重組蛋白方式外源性地增高NGF水平能保護細胞免受凋亡［7］。上述現象提示NGF對心肌細胞病理性損傷的保護效應也可能通過其心臟神經調節以外的方式產生。因此，本實驗選取培養的H9c2心肌細胞株，排除心臟神經對細胞的自身調控作用，研究NGF對H9c2心肌細胞缺氧／復氧損傷的抗凋亡作用及機制，以求更有效、全面的藥物防治措施。

1 材料與方法

1.1 細胞株與分組 H9c2心肌細胞株（購自廣州吉妮歐生物科技有限公司）。將培養的H9c2心肌細胞隨機分為5組：正常對照組（C組）、缺氧／復氧組（H／R組）、NGF組（N組）、NGF＋PI3k受體特異性阻斷劑LY294002組（N＋L組）和LY294002組（L組）。

1.2 藥物 鼠源 β-NGF（Prospec）；LY294002（Sigma）。

1.3 主要試劑與儀器 DMEM／F-12培養液（Gibco）；澳洲胎牛血清（Gibco）；Caspase-12、p-Akt和Akt抗體（Sigma）；CCK-8試劑盒（碧云天）；胰蛋白酶（重慶醫科大學生命科學院）；PBS緩沖液（重慶醫科大學生命科學院）；96孔細胞培養板（NEST）；HEPA Class 100型 CO2孵箱（Thermo，USA）；Model 680型酶標儀（BIO-RAD，USA）；FACS Calibur型流式細胞儀（BD，USA）等。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型建立 C組用正常培養液在通有95%空氣＋5%CO2的37℃培養箱內正常培養8 h；H／R組用預先經95%N2＋5%CO2的混合氣飽和1 h的模擬缺氧液置換正常培養液后，放入通有95%N2＋5%CO2的37℃培養箱缺氧培養4 h，然后將模擬缺氧液換用預先經95%空氣＋5%CO2飽和的正常培養液，在正常條件下復氧4 h；N組、N＋L組和L組先缺氧培養4 h（缺氧條件同H／R組），再分別用預先經95%空氣＋5%CO2飽和的含NGF、NGF＋LY294002和LY294002的正常培養液置換模擬缺氧液，在正常條件下復氧 4 h。NGF和LY294002的終濃度分別為0.05 mg·L－1和3 mg·L－1。

1.4.2 測定指標

1.4.2.1 CCK-8法測定細胞存活率 取對數生長期細胞接種于96孔板中，每孔細胞數 ＞1 000個，將培養板在培養箱預培養（37℃，95% 空氣＋5%CO2）條件下過夜。每個實驗組按照上述對應建模方式處理，每組設5個復孔。處理結束后向每孔分別加入CCK-8溶液（每孔100μl加入10μl CCK-8溶液）。以加入相應量細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。在正常條件下孵育1 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（OD）。按公式：存活率／%＝（實驗組OD－空白對照組OD）／（正常對照組OD－空白對照組OD）×100%，重復測定3次。

1.4.2.2 PI染色流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡細胞按不同的實驗要求處理后，消化、收集細胞，用PBS緩沖液清洗2次，應用PI熒光探針標記漏出的DNA，流式細胞儀測定熒光強度值，并以MultiCycle軟件處理分析，計算凋亡率。

1.4.2.3 Western blot法檢測 Caspase-12、p-Akt／Akt的水平 收集處理結束后的細胞，裂解細胞，用PIERCE公司的M2PER試劑抽提蛋白、BCA方法檢測蛋白濃度，按Western blot方法取20μg蛋白與等體積樣品緩沖液混合，煮沸5 min，SDS-PAGE凝膠電泳。電轉移至硝酸纖維素（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉 3 h，用 0.1%PBST清洗，分別加入Caspase-12、p-Akt／Akt抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，PBST清洗3次，加入相應二抗室溫孵育1 h，PBST清洗3次，ECL顯色。將PVDF膜放入凝膠掃描系統曝光及圖片掃描成像。采用Quantity One軟件計算分析各蛋白條帶和對應的內參蛋白（GAPDH）條帶的灰度。

1.4.3 統計學方法 計量資料以ˉx±s表示，用SPSS 17.0統計軟件處理。數據行方差齊性檢驗，方差齊者組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）；方差不齊者用Games Howell檢驗。

2 結果

2.1 NGF處理對H9c2心肌細胞H／R損傷后存活率的影響 H／R組細胞存活率明顯降低，與C組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；N組細胞存活率升高，與 H／R組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；N＋L組和L組存活率明顯降低，與N組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見Fig 1。

Fig 1 Effect of NGF on the survival rates of H9c2 cardiac myocytes exposed to simulated hypoxia／reoxygenation

2.2 NGF處理對H9c2心肌細胞H／R損傷后凋亡率的影響 C組細胞凋亡不明顯（＜5%），H／R組凋亡率明顯升高（P＜0.05）；N組的凋亡率下降，與H／R組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；N＋L組和L組凋亡率明顯升高，與N組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見 Fig 2。

Fig 2 Effect of NGF on the apoptosis rates of H9c2 cardiac myocytes exposed to simulated hypoxia／reoxygenation

2.3 NGF處理對H9c2心肌細胞H／R損傷后內質網應激蛋白Caspase-12表達的影響 與C組相比，H／R組Caspase-12的表達明顯增加（P＜0.05）；與H／R組相比，N組 Caspase-12表達明顯降低（P＜0.05）；與N組相比，N＋L組和 L組Caspase-12表達明顯增加（P＜0.05）。見Fig 3。

2.4 NGF處理對H9c2心肌細胞H／R損傷后p-Akt／Akt表達量的影響 與 C組相比，H／R組、N組、N＋L組和L組均明顯上調p-Akt／Akt的水平（P＜0.05）；與 H／R組相比，N組 p-Akt／Akt差異無統計學意義（P＞0.05）；與N組相比，N＋L組和L組p-Akt／Akt差異同樣無統計學意義（P＞0.05）。上述濃度的NGF對總Akt水平無明顯影響。見Fig 4。

3 討論

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是受眾多病理生理（如心肌缺血／再灌注損傷）、藥理、毒理因素影響，破壞內質網的穩態，并通過相應信號通路引起細胞內一系列反應，其參與細胞凋亡過程。離體或在體實驗表明，內質網關鍵分子伴侶GRP78在監測內質網中未折疊蛋白的聚集和ERS的激活過程中發揮重要作用［8－10］。正常情況下GRP78與PERK、IRE-1蛋白結合，阻止凋亡通路的激活；若ERS過強，產生的未折疊蛋白則更易與GRP78結合，導致GRP78與PERK、IRE-1蛋白解離使凋亡通路激活。IRE-1持續激活引起TRAF2－ASK1－JNK和 TRAF2－Caspase-12－Caspase-9-Caspase-3凋亡通路的激活，從而導致細胞凋亡。

Fig 3 Effect of NGF on the expression of Caspase-12 of H9c2 cardiac myocytes exposed to simulated hypoxia／reoxygenation

外源性NGF可激活細胞PI3k-Akt信號通路，增加GRP78的表達，滅活內質網應激蛋白Caspase-12，抑制其下游級聯反應，抑制ERS引發的細胞凋亡［11－13］。同時NGF可通過 TrkA途徑減弱鈣通道易化，減少心肌缺血／再灌注損傷［14］。本次實驗也證明，加入外源性NGF后p-Akt水平明顯上調，而內質網應激蛋白Caspase-12水平明顯下調；單獨加入PI3k受體特異性阻斷劑LY294002后，p-Akt水平和內質網應激蛋白Caspase-12未發生明顯改變，提示NGF可能通過PI3k-Akt通路對H9c2心肌細胞H／R損傷產生保護作用。但本次實驗發現，H／R組p-Akt／Akt也較 C組上調（P＜0.05），其原因可能為在應激條件下，細胞自身為減輕凋亡而通過其他通路代償性上調p-Akt／Akt，但該代償性上調不能滿足正常生理功能，最終導致細胞凋亡。雖然N＋L組也加入了LY294002，但是該組各項指標與H／R組相比也有一定改善（未達到統計學差異），可能是由于LY294002未完全阻斷PI3k受體而造成的。

Fig 4 Effect of NGF on the expression of p-Akt／Akt of H9c2 cardiac myocytes exposed to simulated hypoxia／reoxygenation

綜上所述，本實驗以培養的H9c2心肌細胞為研究對象，排除了心臟神經對細胞的自身調控作用，發現了NGF對H9c2心肌細胞缺氧／復氧損傷有保護作用。其可能機制是NGF與其特異性受體TrkA結合后，在內質網外激活PI3k-Akt信號通路，通過上調p-Akt水平以減弱內質網應激引發的凋亡，并且在ERS的PERK、IRE-1下游信號通路中，減少內質網應激蛋白Caspase-12的產生，對減少細胞凋亡起協同作用。這種調控為非神經源性的心肌保護性效應。

本實驗探討了NGF對H9c2心肌細胞H／R損傷的抗凋亡作用及機制，尚未與NGF預處理進行比較，有待于下一步工作繼續研究。

參考文獻：

［1］ Caporali A，Emanueli C.Cardiovascular actions of neurotrophins［J］.Physiol Rev，2009，89（1）：279－308.

［2］ Nemoto K，Fukamachi K，Nemoto F，et al.Gene expression of neurotrophins and their receptors in cultured rat vascular smooth muscle cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，245（1）：284－8.

［3］ 孟金蘭，陳雅嘉，陳 紅，等.P13K／Akt信號通路在硫化氫保護PC 12細胞對抗化學性缺氧損傷的作用［J］.中國藥理學通報，2013，29（2）：257－61.

［3］ Meng JL，Chen Y J，Chen H，et al.Role of PI3K／Akt in protective effect of hydrogen sulfide against PC12 cells injuries induced by chemical hypoxia［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：257－61.

［4］ Webster K A.Aktion in the nucleus［J］.Circ Res，2004，94：856－9.

［5］ Meloni M，Caporali A，Graiani G，et al.Nerve growth factor promotes cardiac repair following myocardial infarction［J］.Circ Res，2010，106（7）：1275－84.

［6］ Dhanasekaran A，Gruenloh SK，Buonaccorsi JN，et al.Multiple antiapoptotic targets of the PI3K／Akt survival pathway are activated by epoxyeicosatrienoic acids to protect cardiomyocytes from hypoxia／anoxia［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294（2）：H724－H35.

［7］ Caporali A，Sala-Newby G B，Meloni M，et al.Identification of the prosurvival activity of nerve growth factor on cardiac myocytes［J］.Cell Death Differ，2008，15（2）：299－311.

［8］ 馬青變，高 煒，郭艷紅，等.缺氧復氧誘導大鼠心肌細胞內質網應激反應［J］.北京大學學報（醫學版），2005，37（8）：386－7.

［8］ Ma QB，Gao W，Guo Y H，et al.Hypoxia／reoxygenation induced endoplasmic reticulum stress in cultured neonatal rat cardiomyocyte［J］.J Peking Univ（Health Sciences），2005，37（8）：386－7.

［9］ Martindale JJ，Fernandez R，Thuerauf D，et al.Endoplasmic reticulum stress gene induction and protection from ischemia／reperfusion injury in the hearts of transgenic micewith a tamoxifen-regulated form of ATF6［J］.Circ Res，2006，98（9）：1186－93.

［10］Qi X，Vallentin A，Churchill E，et al.Delta PKC participates in the endoplasmic reticulum stress-induced response in cultured cardiac myocytes and ischemic heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，43（4）：420－8.

［11］Kishi S，Shimoke K，Nakatani Y，et al.Nerve growth factor attenuates2-deoxy-d-glucose-triggered endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis via enhanced expression of GRP78［J］.Neurosci Res，2010，66（1）：14－21.

［12］Shimoke K，Amano H，Kishi S，et al.Nerve growth factor attenuates endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis via suppression of caspase-12 activity［J］.J Biochem，2004，135（3）：439－46.

［13］Shimoke K，Kishi S，Utsumi T，et al.NGF-induced phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway prevents thapsigargin-triggered ER stress-mediated apoptosis in PC12 cells［J］.Neurosci Lett，2005，389（3）：124－8.

［14］Endoh T，Sato D，Wada Y，et al，Nerve growth factor and brainderived neurotrophic factor attenuate angiotensin-Ⅱ-induced facilitation of calcium channels in acutely dissociated nucleus tractus solitarii neurons of the rat［J］.Arch Oral Biol，2008，53（12）：1192－201.