黃芩素激活核轉錄因子Nrf2拮抗肝毒性的研究

龐 純，蔣 萍，季莉莉

黃芩素是中藥黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）中含有的重要單體，屬黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、保肝利膽、利尿、抗癌等多種藥理作用，臨床主要用于抗菌消炎和抗感染［1］。黃芩素的結構中含酚羥基較多，因此可以與自由基反應生成穩定的半醌自由基從而發揮抗氧化作用。本實驗室前期研究發現黃芩素可以抑制川楝素、千里光堿、APAP等肝毒性物質誘導的L-02細胞和小鼠原代肝細胞的毒性［2－3］，但是其抑制肝毒性的作用機制尚不清楚。

近年來研究發現，核因子NF-E2相關因子（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）可以通過與抗氧化反應元件 （antioxidant responsive element，ARE）相互作用從而調節編碼一些重要的抗氧化蛋白，這是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路［4］。大量研究表明［5～7］，氧化應激在APAP、CCl4、乙醇等肝毒性物質誘導的肝細胞損傷中發揮了重要的作用。本研究采用瞬時轉染報告基因實驗，依靠雙熒光素酶報告基因載體和轉染技術，檢測不同濃度黃芩素對核轉錄因子Nrf2的轉錄激活；并進一步考察了黃芩素對肝毒性物質APAP、CCl4、乙醇誘導的肝L-02細胞毒性的影響。

1 材料與試劑

1.1 細胞株 人正常肝細胞株L-02（中國科學院細胞庫）。

1.2 藥物 黃芩素由上海中藥標準化中心提供，化合物結構主要經核磁共振氫譜（1H-NMR）和核磁共振碳譜（13C-NMR）鑒定，純度98%以上。

1.3 試劑 對乙酰氨基酚 （APAP）、溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）2，5-二甲苯基四氮唑 （MTT）（Sigma公司）；無水乙醇、四氯化碳（上海國藥集團有限公司）；Penicillin／Streptomycin、胎牛血清（FBS）、RPMI 1640和 Opti-MEM培養基 （Gibco公司）；Nrf2 Cignal Reporter Assay試劑盒、Attractene轉染試劑（QIAGEN公司）。

1.4 儀器 恒溫培養箱（Thermo），生物安全柜（Labconoc），BioTek Synergy H4酶標儀（Bio-Tek），離心機（Eppendorf），熒光倒置顯微鏡（Olympus），超純水過濾儀（MILLIPORE），培養皿、96孔培養板、離心管（Greiner）。

2 方法

2.1 藥物配制 黃芩素用二甲亞砜（DMSO）溶解，配制成0.1 mol·L－1的母液；APAP用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，配制成 0.1 mol·L－1的母液，用0.22 μm的一次性滅菌濾器過濾除菌；CCl4用4.82 ml原液溶于 5.18 ml DMSO中，配制成 5 mol·L－1的CCl4母液；Ethanol用0.58 ml的無水乙醇混于無血清的RPMI 1640培養液配成10 ml的1 mol·L－1母液。加藥時用無血清的RPMI 1640培養液按比例稀釋至所需濃度，并確保DMSO在培養液中的終濃度不超過0.1%。

2.2 細胞培養 將人正常肝L-02細胞接種于含10%滅活胎牛血清、10萬U·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的 RPMI 1640培養液中，在 37℃，5%CO2的培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.3 Cignal報告基因法檢測Nrf2的激活 轉染前24 h，按細胞數3×104個／孔接種細胞至96孔培養板。根據試劑盒說明書，轉染時分別將Cignal報告基因質粒、Cignal陰性對照質粒、Cignal陽性對照質粒與Attractene轉染試劑以及Opti-MEM培養基混勻孵育后加入96孔板，置培養箱培養16 h后，更換為含0.5%FBS的Opti-MEM培養液，同時在熒光顯微鏡（激發波長470 nm＋20 nm，發射波長515 nm）下檢測Cignal陽性對照質粒的轉染效率。轉染24 h后加不同濃度的黃芩素（0、10、25、50μmol·L－1），孵育18 h后用雙熒光素酶活性分析試劑盒提供的方法，在酶標儀上分別測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性值，結果以兩者的比值表示。

2.4 MTT法檢測細胞存活率 取對數生長期的細胞，制成細胞懸液，以1×104個／孔接種到96孔板中，12 h后，細胞貼壁生長狀態良好，加入不同濃度黃芩素（1、10、25、50、100μmol·L－1）與細胞預孵15 min后，加入肝細胞毒性物質（終濃度10 mmol·L－1APAP，100 mmol·L－1Ethanol，10 mmol·L－1CCl4，各組均沒有明顯的pH變化）。空白對照組加入含等量DMSO的細胞培養液而不加任何藥物。共同孵育48 h后加入MTT 10μl（終濃度0.5 g·L－1），置培養箱孵育4 h后加三聯劑 （10%SDS－5%異丁醇 －0.01 mol·L－1HCl），繼續培養至結晶完全溶解，然后取出96孔板，在酶標儀570 nm和630 nm參考波長處讀取吸光度值。將空白組作為對照，按下述公式計算細胞存活率：細胞存活率／%＝給藥組OD（570 nm－630 nm）／對照組OD（570 nm－630 nm）×100%。

2.5 統計學處理 實驗數據均用ˉx±s表示，采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，以One-Way ANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用LSD法。

3 結果

3.1 黃芩素明顯誘導Nrf2的轉錄激活 與對照組比較，10μmol·L－1黃芩素對Nrf2的轉錄激活沒有明顯的影響（P＞0.05），而25和50μmol·L－1黃芩素能明顯提高 Nrf2的轉錄激活（P＜0.01，P＜0.05），見 Fig 1。

3.2 黃芩素明顯逆轉給予APAP、CCl4和Ethanol后降低的L-02細胞存活率 與對照組比較，APAP、CCl4、Ethanol均能明顯降低人正常肝L-02細胞存活率 （P＜0.01）；細胞經不同濃度黃芩素 （1、10、25、50、100μmol·L－1）預處理15 min后，各濃度黃芩素均能明顯提高APAP肝細胞損傷模型組的細胞存活率（P＜0.01），且呈現一定的劑量依賴性；25、50、100 μmol·L－1黃芩素能明顯提高CCl4肝細胞損傷模型組的細胞存活率（P＜0.01），且呈現一定的劑量依賴性；50、100μmol·L－1黃芩素對 Ethanol肝細胞毒性具有明顯拮抗作用 （P＜0.01），見Tab 1。

Fig 1 Effects of Baicalein on the activation of Nrf2

Tab 1 Protection of Baicalein against APAP，CCl4，and Ethanol-induced hepatotoxicity in L-02 cells（ˉx±s，n＝5）

4 討論

肝臟是人體最重要的代謝器官，外源性物質在肝內經氧化還原后產生多種自由基，可引起肝組織的氧化損傷。氧化應激產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接或間接地損傷細胞內蛋白質、脂質等大分子物質的生理功能，機體形成了一套復雜的氧化應激應答系統來應對自由基和有毒物質的損害［8］。Nrf2是調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子，其通過與ARE相互作用調節編碼抗氧化蛋白的表達［4，9］。正常情況下，Nrf2作用被其特異性受體Keap1所抑制；在氧化應激等情況下，Nrf2與Keap1解離而被激活，啟動ARE調控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表達，增加細胞抵御氧化應激和親電子化學物質的損傷［9－10］。

大量研究表明，APAP、CCl4、乙醇誘導的肝毒性均與氧化應激產生的自由基導致肝臟氧化損傷密切相關。Liu等［11］和 Reisman等［12］證明：對乙酰氨基酚、四氯化碳、鎘、溴苯等均能降低大鼠及小鼠肝臟Nrf2及其下游的抗氧化酶基因 NQO1（NADPH：quinine oxygenase 1）、HO-1（heme oxygenase 1）等的表達，而齊墩果酸可逆轉這些基因表達的降低。又有文獻報道［13－14］，Nrf2（－／－）小鼠對 APAP和CCl4誘導的肝毒性比野生型小鼠更敏感。Lamlé等［15］報道：Nrf2（－／－）小鼠對酒精的耐受性比野生型小鼠明顯降低，短時間內就能發生肝衰竭，最終導致死亡。因此，抗氧化成為治療APAP、乙醇等誘導的肝損傷的一個重要手段。

本研究應用Cignal Reporter法檢測到黃芩素能明顯提高Nrf2的轉錄活化，并發現黃芩素對肝毒性物質APAP、CCl4和Ethanol誘導的 L-02肝細胞毒性有明顯的抑制作用。我們結果提示黃芩素可能是通過提高細胞內重要的抗氧化轉錄因子Nrf2的激活，從而發揮抑制APAP、CCl4和Ethanol誘導肝細胞毒性的作用。

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