雷公藤甲素誘導鼻咽癌細胞凋亡作用

王 秀，張競競，張 配，孫小錦，劉 哲，張鑫宇，劉 浩

雷公藤甲素（triptolide，TPL）又稱雷公藤內酯、雷公藤內酯醇，是從衛矛科雷公藤屬植物中分離的一種環氧二帖類內酯化合物，是治療類風濕病雷公藤片和雷公藤多苷片等制劑的主要有效成分［1］。現代研究表明，雷公藤甲素不僅具有高效的抗炎、抗類風濕作用，還具有較強的抗腫瘤作用。研究發現，其對某些腫瘤細胞的殺傷毒性甚至高于紫杉醇和阿霉素［2－3］。但在鼻咽癌中的研究較少，本文擬將雷公藤甲素作用于鼻咽癌CNE-2Z細胞株，觀察其抗鼻咽癌的作用，并探討作用的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 雷公藤甲素（天津美倫醫藥集團）；CNE-2Z細胞株，蚌埠醫學院藥學系生化藥理實驗中心提供；RPMI 1640培養基（Gibco公司）；兔抗人GRP78、Akt、pAkt抗體、鼠抗人 β-actin抗體購自Santa Cruz公司；山羊抗鼠 IgG、山羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ROS熒光探針-DHE（威格拉斯生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥液配制 雷公藤甲素用二甲基亞砜（DMSO）配成 5.5 mmol·L－1貯液，－20℃保存。臨用前以 RPMI 1640培養基稀釋成 62.5、125、250、500、1 000、2 000及 4 000 nmol·L－1。

1.2.2 細胞培養 CNE-2Z細胞接種于含10%新生小牛血清、青霉素（1×105U·L－1）、鏈霉素（100 mg·L－1）和 NaHCO3（33.7 mg·L－1）的 RPMI 1640培養液中，體積分數0.05 CO2、飽和濕度、37℃培養箱中培養，每2～3天傳代1次。

1.2.3 MTT測定細胞的增殖活性 細胞接種于96孔細胞培養板中，5×103個每孔。培養24 h，吸棄培養液，加新鮮含10%血清培養液180μl，對照組加入含0.01%DMSO的培養液20μl；藥物處理組加入不同濃度的雷公藤甲素溶液各20μl，使終濃度分別為 6.25、12.5、25、50、100、200及 400 nmol·L－1，其中DMSO含量不超過0.01%；同時設立調零組（無細胞組），加入200μl培養液。培養12、24、48 h后加入20μl MTT（以 PBS配成5 g·L－1），37℃繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150μl DMSO，37℃孵育30 min，酶標儀上振蕩10 min，檢測波長570 nm處吸光度（A）值，計算細胞存活率：細胞存活率／%＝（實驗組A值－調零組A值）／（對照組A值－調零組A值）×100%。以上實驗重復3次。

1.2.4 PI單染法測定雷公藤甲素對CNE-2Z細胞凋亡的影響 細胞接種于6孔培養板，5×106個每孔，培養24 h后，加藥處理，使雷公藤甲素的終濃度為 25、50、100 nmol·L－1，繼續培養 24 h，顯微鏡下觀察各處理組細胞的變化并拍照，收集細胞，2 500 r·min－1，離心5 min，洗滌2次；預冷的體積分數為0.75乙醇固定，4℃過夜。測試前用PBS溶液洗滌2遍，加 PI緩沖液（5 mg PI、0.1 g NaC6H5、100μl Triton-100、100μl ddH2O）300μl每管，避光染色30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot測定雷公藤甲素對CNE-2Z細胞內GRP-78、Akt的表達及Akt磷酸化的影響 將指數生長的CNE-2Z細胞胰酶消化、懸浮、計數，調節細胞濃度為3×108個·L－1，接種于6孔培養板，每孔2 ml，貼壁培養24 h，棄培養液，加藥處理24 h后冰上提取細胞全蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉膜；封閉2 h，加一抗，4℃ 孵育過夜；洗膜后加二抗，室溫孵育2 h；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate試劑盒用Bio-Rad凝膠成像系統獲取圖像。

1.2.6 雷公藤甲素對CNE-2Z細胞內活性氧水平的影響 ROS熒光探針－二氫乙啶（dihydroethidium，DHE），可自由透過活細胞膜進入細胞內，并被細胞內的ROS氧化，形成氧化乙啶。氧化乙啶可參入染色體DNA中，產生紅色熒光。根據活細胞中紅色熒光的產生，可以判斷細胞ROS含量的多少和變化。將貼壁生長的CNE-2Z細胞用胰酶消化、懸浮，以5×106個每孔接種于6孔培養板，貼壁生長24 h，棄培養液，給藥處理4 h，加入二氫乙啶使其終濃度為5μmol·L－1，37℃避光孵育 1 h，棄培養液，冰冷 PBS洗 3遍，胰酶消化，離心（800 r·min－1，5 min），收集細胞，用1 ml冰冷PBS重懸細胞，流式細胞儀測定，采用480～535 nm波長激發，590 nm～610 nm以上的發射，細胞可分成兩個亞群：ROS陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS陽性細胞有較強的紅色熒光。

2 結果

2．1 雷公藤甲素對鼻咽癌細胞CNE-2Z的抑制作用 MTT結果顯示，雷公藤甲素對鼻咽癌細胞CNE-2Z具有較強的抑制作用，并且這種抑制作用隨著濃度的增加及作用時間的延長而增強，見Fig 1。25、50和100 nmol·L－1雷公藤甲素處理 CNE-2Z細胞48 h后，鏡下清晰可見隨著濃度的增加漂浮細胞增加，細胞密度降低，見Fig 2。

Fig 1 Triptolide inhibits proliferation of CNE-2Z cells

Fig 2 The morphological change of CNE-2Z cells after triptolide treatment

2．2 雷公藤甲素對鼻咽癌細胞CNE-2Z凋亡的影響 由 Fig 3可見，25、50和 100 nmol·L－1的雷公藤甲素作用CNE-2Z細胞24 h，均可引起CNE-2Z細胞的凋亡，其中100 nmol·L－1組的凋亡率達到了34.4%，占到整個抑制率46.2%的74%。

2．3 雷公藤甲素對CNE-2Z細胞內GRP78、Akt、p Akt的影響 實驗結果表明，雷公藤甲素作用CNE-2Z細胞24 h后，對細胞內GRP-78蛋白的表達無明顯影響，但可明顯減少Akt的表達及其磷酸化水平，見Fig 4。

2．4 雷公藤甲素對CNE-2Z細胞內ROS水平的影響 活性氧實驗表明，不同濃度的雷公藤甲素均能誘導鼻咽癌細胞CNE-2Z產生氧化應激。由Fig 5可見，隨著雷公藤甲素濃度的升高，CNE-2Z細胞內ROS水平增加。

Fig 3 Triptolide induces apoptosis of CNE-2Z cells

Fig 4 Effect of triptolide on expression of GRP-78，Akt and pAkt

Fig 5 Reactive oxygen species level elevated in CNE-2Z cells

3 討論

雷公藤甲素具有廣譜、高效的抗腫瘤作用，對急性白血病、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等都有較高活性［4－5］。研究表明，其高效的抗腫瘤作用主要通過誘導腫瘤細胞凋亡實現［6－7］，但其誘導腫瘤細胞凋亡的機制目前尚不清楚。實驗發現，雷公藤甲素對鼻咽癌也具有較強的抑制作用，同樣通過誘導鼻咽癌細胞凋亡實現。其誘導細胞凋亡的作用可能與其誘導氧化應激，升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，及抑制 Akt有關。

ROS由超氧離子、過氧化氫和羥自由基組成，是細胞代謝的副產品。ROS水平對細胞生死有著重要的影響。生理情況下的ROS量小，作為信號傳導分子參與調解細胞的生理活動［8］。輕度氧化應激，ROS水平輕度升高，可促進細胞存活、增殖、分化等適應性變化；重度氧化應激可使ROS劇烈增加，則造成細胞增殖阻滯、衰老、凋亡和壞死等損傷性變化［9］。腫瘤組織由于高代謝、低氧、缺血等，會持續誘發氧化應激，使腫瘤組織內ROS升高，促進腫瘤細胞的存活、增殖、侵襲、轉移等。但若腫瘤細胞內ROS水平進一步升高，則抑制腫瘤細胞的增殖，促進細胞的凋亡。腫瘤治療藥物誘導細胞凋亡部分與生成內源性氧化劑有關［10］。易靜等［11］研究表明，腫瘤細胞內的ROS水平，決定了細胞對凋亡的敏感性。實驗中細胞內ROS水平及細胞凋亡率隨著雷公藤甲素濃度的增加而升高，說明細胞的凋亡與雷公藤甲素誘導氧化應激，產生較高水平的ROS有關。

Akt是原癌基因c-Akt的表達產物，又稱蛋白激酶B，在細胞凋亡、細胞增殖、細胞分化、生理代謝、衰老及疾病和癌癥等細胞生理病理活動的調控中起著至關重要的作用。當細胞面臨氧化損傷時，PI3K／Akt通路的活化對細胞存活非常重要。研究［12］發現，激活Akt能保護細胞免受H2O2的損傷。反之，若Akt的活化受到抑制，細胞就失去了保護，在氧化應激的刺激下，細胞發生損傷，進而凋亡。實驗表明，雷公藤甲素可抑制Akt的表達及磷酸化，這一作用可能是雷公藤甲素誘導鼻咽癌細胞CNE-2Z凋亡的主要原因。

總之，雷公藤甲素能夠通過誘導細胞凋亡，抑制鼻咽癌細胞CNE-2Z的生長，作用的機制可能與其誘導氧化應激及抑制Akt的表達及活化有關，具體機制有待于進一步的研究。

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