冷凍干燥過程中重要參數(shù)塌陷溫度的研究

楊智，李代禧，張燕，郭柏松，楊春生，趙鳳

(1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 201108;2.上海東富龍科技股份有限公司，上海 201108)

冷凍干燥是目前廣泛應(yīng)用的生物制品保存方法［1］，但是凍干過程干燥速率低、時(shí)間長(zhǎng)、能耗大等不足，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，因此優(yōu)化和改進(jìn)凍干過程是當(dāng)前面臨的重要問題［2］。冷凍干燥過程可分為預(yù)凍、一次干燥、二次干燥［3］。其中一次干燥是整個(gè)冷凍干燥過程中周期最長(zhǎng)的階段，一次干燥周期又與其升華時(shí)的溫度相關(guān)。如果能盡量提高一次升華時(shí)的樣品溫度，就可以很大程度上縮短升華干燥時(shí)間。樣品溫度每升高1℃，干燥時(shí)間縮短13%［2，4］。但生物制品溫度過高，會(huì)引起塌陷或者熔融，進(jìn)而導(dǎo)致干燥層的多孔結(jié)構(gòu)喪失、殘余水分增多、復(fù)水時(shí)間延長(zhǎng)，嚴(yán)重的將會(huì)導(dǎo)致生物制品活性喪失。因此，冷凍干燥中尋找一次升華時(shí)的臨界溫度尤為重要。

目前絕大多數(shù)都是以共熔溫度作為一次升華時(shí)的臨界溫度，很少關(guān)于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg，塌陷溫度Tc的數(shù)據(jù)更是甚少提到［5-6］。關(guān)于制品的塌陷溫度和相應(yīng)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度/共熔溫度之間的相互關(guān)系幾乎沒有被研究過。

本文利用凍干顯微鏡和差示掃描量熱儀研究氯化鈉鹽溶液、蔗糖水溶液、海藻糖水溶液和甘露醇水溶液的塌陷溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，分析研究?jī)烧咧g的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

純化水，自制;果糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、氯化鈉均為分析純;液氮(純度＞99.999%);氮?dú)?純度＞99.99%)。

LYOSTAT2凍干顯微鏡;差示掃描量熱儀(DSC);純水儀(明澈TM-D 24UV純水系統(tǒng) );XS205電子天平;水系針筒式濾膜過濾器，自制。

1.2 溶液制備

按質(zhì)量濃度配制供試品溶液，以配制2%蔗糖為例。用電子天平精密稱取蔗糖0.200 0 g，加純化水至10.000 0 g溶解，用 0.22 μL濾膜過濾待用。其他供試品溶液依此法配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 崩解溫度測(cè)定 采用凍干顯微鏡(配有液氮冷卻系統(tǒng)、可編程溫度控制器和真空泵)測(cè)量。顯微鏡放大倍數(shù)為100倍。載玻片上放置一銀環(huán)，取2 μL樣品溶液于銀環(huán)和光源中間，壓力保持在1 Pa。溫度標(biāo)定采用氯化鎂、氯化鈉和氯化鉀(共晶熔融溫度分別為 －33.6，－21.1，－10.7 ℃)。樣品以10℃/min從25℃降溫至－55℃，等溫5 min，抽真空，然后以2℃/min升溫。本文中的塌陷溫度Tc為樣品在干燥界面和冷凍界面交界處出現(xiàn)亮點(diǎn)時(shí)的溫度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 DSC檢測(cè) 吹掃氣體采用50 mL/min左右速率的氮?dú)?純度＞99.99%，氮?dú)庠诟咧?00℃的溫度范圍內(nèi)都是惰性的，因此是DSC測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)氣體)。溫度標(biāo)定采用銦和鋅(熔融溫度分別為156.6℃和419.47℃)。樣品皿采用鋁坩堝，蓋鉆孔，用壓片機(jī)壓制。樣品質(zhì)量濃度分別為2%，5%，8%。在參比側(cè)放置與樣品皿相同的空皿。樣品均以10℃/min從25℃降溫至－55℃，等溫5 min，然后以2℃/min升溫至20℃。在升溫掃描時(shí)讀取數(shù)據(jù)，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg，取中點(diǎn)溫度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 崩解溫度

顯微鏡凍干實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于降溫時(shí)發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變的樣品，如果糖、蔗糖和海藻糖，其水溶液升溫時(shí)均發(fā)生塌陷，臨界溫度為塌陷溫度。塌陷溫度可分為微塌陷溫度和塌陷溫度。前者表示的是樣品結(jié)構(gòu)的局部喪失，干燥界面與升華界面交界處出現(xiàn)小的孔洞或裂縫;后者對(duì)應(yīng)樣品結(jié)構(gòu)的整體喪失，干燥界面與升華界面交界處出現(xiàn)大的孔洞或裂縫，干燥界面與升華界面已不再相連。本實(shí)驗(yàn)定義的塌陷溫度為微塌陷溫度。降溫速率為10℃/min，升溫速率為2℃/min條件下，各物質(zhì)在不同濃度時(shí)的塌陷溫度、共晶熔融溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度見表1。

表1 二元水溶液的塌陷溫度(Tc)、共晶熔融溫度(Tem)和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(T'g)Table 1 Collapse temperature(Tc)，eutectic melting temperature(Tem)and glass transition temperature(T'g)of aqueous solutions

由表1可知，果糖、蔗糖和海藻糖的塌陷溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度均隨樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，這與文獻(xiàn)［7-9］結(jié)論一致。

降溫速率對(duì)物質(zhì)的塌陷溫度的影響見表2。

表2 不同質(zhì)量濃度蔗糖溶液在不同降溫速率下的塌陷溫度Table 2 Collapse temperature of sucrose under different cooling rate

由表2可知，3種溶液濃度的塌陷溫度均隨降溫速率的增大而減少。因?yàn)樵趦龈蛇^程中，降溫速率過快，會(huì)導(dǎo)致結(jié)晶不充分，生成的冰晶顆粒較大，升華時(shí)傳質(zhì)阻力變大，升華速率降低，塌陷溫度就會(huì)減小。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，甘露醇在升溫過程中未發(fā)生崩解，該物質(zhì)熱穩(wěn)定性較好，作為保護(hù)劑，可以很好地提高凍干樣品的塌陷溫度，從而提高樣品預(yù)凍溫度，大大縮短干燥時(shí)間，降低成本。

圖1是甘露醇水溶液的顯微圖像。

從圖中可以直觀看出，在整個(gè)干燥過程中，溶液都未發(fā)生崩解，直至全部升華。

圖1 2%甘露醇溶液的凍干顯微圖像Fig.1 Microscopic observations of freeze-drying of 2%mannitol aqueous solution

圖2為2%海藻糖水溶液的凍干顯微圖像。

圖2 2%海藻糖溶液的凍干顯微圖像Fig.2 Microscopic observations of freeze-drying of 2%trehalose aqueous solution

由圖2可知，在－26.9℃時(shí)，干燥界面和凍結(jié)界面結(jié)構(gòu)都比較完好，沒有發(fā)生任何塌陷;當(dāng)樣品溫度升高到－26.6℃時(shí)開始發(fā)生塌陷，干燥界面與凍結(jié)界面交界處局部出現(xiàn)了小的孔洞，孔洞不相連，但隨著溫度的升高，孔洞會(huì)逐漸變大，并連成一片，直至整體塌陷。此時(shí)升華界面移動(dòng)速度明顯降低，表明干燥層的粘性流動(dòng)堵塞了水蒸氣逸出通道。

2.2 塌陷溫度與相應(yīng)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度分析

由表1可知:①蔗糖和海藻糖的塌陷溫度都比其相應(yīng)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度略高些，差值在5℃左右。因此，以玻璃化轉(zhuǎn)變溫度作為臨界溫度有些保守，而應(yīng)以塌陷溫度作為臨界溫度。另外，塌陷溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度/共晶熔融溫度的實(shí)驗(yàn)環(huán)境不同，塌陷溫度是利用FDM在真正的冷凍干燥過程中測(cè)得的;而玻璃化轉(zhuǎn)變溫度/共晶熔融溫度是利用DSC在封閉環(huán)境下測(cè)得的，所以，對(duì)于晶體或是非晶體，塌陷溫度作為一次升華溫度都更能真實(shí)地反映產(chǎn)品特性;②無論是玻璃化轉(zhuǎn)變溫度還是塌陷溫度，都隨著樣品分子量的增大而呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此選用凍干保護(hù)劑時(shí)，在保證產(chǎn)品品質(zhì)的情況下，應(yīng)優(yōu)先選用大分子保護(hù)劑，以提高升華干燥溫度，縮短干燥時(shí)間，降低生產(chǎn)成本。

在DSC實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甘露醇在升溫過程中－25℃時(shí)出現(xiàn)一個(gè)放熱峰，且明顯低于在降溫過程中生成的結(jié)晶放熱峰。

圖3 甘露醇的DSC曲線圖Fig.3 DSC curve of mannitol

經(jīng)分析該峰為冷結(jié)晶峰。冷結(jié)晶是由于物質(zhì)內(nèi)部該結(jié)晶的部分，因?yàn)闇囟扰c時(shí)間的限制，無法完全結(jié)晶，當(dāng)溫度高于T'g后，這些未完成結(jié)晶的部分由于分子鏈柔軟而具有足夠的運(yùn)動(dòng)能力，重新排列成為新生結(jié)晶的現(xiàn)象［10-11］。冷結(jié)晶過程中分子鏈排列從無序到有序，是一個(gè)熵減的過程，會(huì)放出熱量，在DSC掃描曲線上呈現(xiàn)放熱峰，溫度值小于熔融溫度。

對(duì)于降溫時(shí)發(fā)生共晶的樣品，如氯化鈉，其水溶液升溫到共晶熔融溫度時(shí)，凍結(jié)層和干燥層整體發(fā)生融化。

圖4為氯化鈉水溶液的凍干顯微圖像。

由圖4可知，氯化鈉溶液在－20.4℃時(shí)，干燥界面和冷凍界面結(jié)構(gòu)都完整;而達(dá)到塌陷溫度－20.2℃，整體發(fā)生了融化。

圖4 5%氯化鈉水溶液的凍干顯微圖像Fig.4 Microscopic observations of freeze-drying of 5%NaCl

3 結(jié)論

(1)測(cè)定了氯化鈉、蔗糖、海藻糖和甘露醇等水溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和塌陷溫度。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和熔融溫度是在封閉環(huán)境下測(cè)得的，塌陷溫度是在真正的冷凍干燥過程中測(cè)得的，所以塌陷溫度更能真實(shí)地反應(yīng)產(chǎn)品的特性，對(duì)冷凍干燥具有重要的指導(dǎo)意義。

(2)蔗糖和海藻糖的水溶液在降溫時(shí)發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，塌陷溫度和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度比較接近，但并不相等;而氯化鈉和甘露醇二元水溶液降溫時(shí)發(fā)生結(jié)晶，塌陷溫度與熔融溫度也不相等，其中甘露醇在升華過程中未發(fā)生崩解。

(3)塌陷溫度一般都比相應(yīng)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高5℃左右。因此，降溫過程中，樣品不論是發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變還是結(jié)晶，均以塌陷溫度作為臨界溫度，可在保證產(chǎn)品品質(zhì)的前提下，提高升華干燥速率，縮短凍干時(shí)間。

(4)樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、降溫速率以及分子量的大小都會(huì)對(duì)塌陷溫度產(chǎn)生影響。質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，降溫速率越小，則塌陷溫度越高。對(duì)于不同的物質(zhì)，分子量大的物質(zhì)，則塌陷溫度大。

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