微波輔助提取牡丹雄蕊總生物堿工藝研究

馬傳利，鄭國生，周遠(yuǎn)明，史美麗

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109)

牡丹(Paeonia suffruticosa)屬于觀賞性植物，多年生落葉小灌木，是我國特有的花卉品種，長期以來中國人民把牡丹花當(dāng)作吉祥富貴、繁榮昌盛的象征。牡丹花不但具有很高的觀賞性和藥用價值，而且還具有很高的食用價值。我國宋代就開始食用牡丹花。明代李時珍的《本草綱目》記載牡丹花是具有清熱解毒功效的傳統(tǒng)中藥材，味較苦、藥性平和，具有和血、生血、涼血的功效，主要治療血中伏火、安神定氣，消除煩熱。近現(xiàn)代藥理學(xué)研究可以發(fā)現(xiàn)，牡丹花中含有紫云英苷、締紋天竺苷、丹皮花苷和多種人體所必需的氨基酸、微量元素和多種維生素［1-3］。因此，開展對牡丹花的有效成分的研究，具有十分重要的應(yīng)用價值。

生物堿(alkaloid)是存在于自然界中的一類含氮的堿性有機化合物，大多數(shù)有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有顯著的生物活性，是中草藥中重要的有效成分之一。本次研究通過對微波提取牡丹雄蕊生物堿的工藝研究，以苦參堿為對照品測定牡丹雄蕊中生物堿的含量［4-6］，希望能確定出牡丹花雄蕊中總生物堿的最佳提取工藝。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

牡丹雄蕊，采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)牡丹園，經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生理教研室鑒定為“鳳丹”品種;苦參堿(生化試劑，含量≥91.7%)，中國藥品生物制品檢定所;溴甲酚綠;無水乙醇、氨水、甲醇、四氯化碳、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氯仿、鹽酸等均為分析純。

XH-100A電腦微波催化/合成萃取儀;UV1601型紫外-可見分光光度計;AR2140電子分析天平。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取于105℃干燥至恒重的苦參堿對照品0.017 0 g，置于小燒杯中，加入適量氯仿溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加氯仿定容，搖勻，即得(每 1 mL含苦參堿0.17 mg)。

1.2.2 緩沖溶液的制備 準(zhǔn)確稱取 3.440 3 g KH2PO4，放入250 mL容量瓶A中，用蒸餾水定容至刻度。準(zhǔn)確稱取1.000 3 g NaOH，放入250 mL容量瓶B中，用蒸餾水定容至刻度。將A和B充分混合后，用鹽酸定pH值至7.5，密封保存。

1.2.3 酸性染料液的制備 精密稱取溴甲酚綠0.050 4 g于100 mL容量瓶中，加入上述緩沖溶液溶解，用水稀釋搖勻，定容，制得0.05%溴甲酚綠緩沖液，備用。

1.3 實驗方法

準(zhǔn)確稱取牡丹雄蕊粉末2.5 g，微波功率為700 W，乙醇濃度70%，料液比(質(zhì)量體積比，g/mL)1 ∶20，浸潤24 h，再微波加熱提取6 min，過濾，測定吸光度值。

1.4 分析方法

1.4.1 檢測波長的確定 精密吸取對照品溶液1.0 mL置于20 mL具塞錐形瓶中，加入氯仿10 mL。另取10 mL氯仿，置另一20 mL具塞錐形瓶中，制備空白液。各加蒸餾水5.0 mL，0.05%溴甲酚綠緩沖液2.0 mL，密塞，劇烈振搖3 min后移入60 mL分液漏斗中，靜置20～30 min。分別取氯仿層置石英比色皿中，在300～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品紫外掃描圖Fig.1 The UV scan spectra of matrine standard

由圖1可知，溶液在410.5 nm波長處有最大吸收。故選擇410.5 nm作為檢測波長。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性建立 準(zhǔn)確量取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.80，0.90，1.00，1.10，1.20，1.30 mL，分別放入6只120 mL分液漏斗中，分別加入氯仿10.00 mL，混勻，靜置。再分別加入pH為7.5的緩沖溶液10.0 mL，溴甲酚綠溶液4.0 mL，振搖后靜置1 h。分別取氯仿層，氯仿試劑為空白參比，在波長410.5 nm處測定吸光度A。用最小二乘法作線性回歸，得到吸光度A與苦參堿濃度c(mg/mL)的線性關(guān)系曲線(見圖2)，該曲線的回歸方程為 A=34.605c－0.434 9，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3。

圖2 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度的曲線圖Fig.2 The curve of concentration to absorbance of standard solution of matrine

1.4.3 總生物堿含量的測定 準(zhǔn)確稱取2.5 g牡丹花雄蕊粉末提取液過濾，濾液轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，用80%乙醇定容至250 mL。取0.80 mL待測液于120 mL分液漏斗中，測定吸光度A。根據(jù)回歸方程計算出待測液中牡丹雄蕊總生物堿的濃度c(mg/mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 料液比對提取總生物堿含量的影響

實驗條件同1.3節(jié)，考察料液比對提取總生物堿的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對提取總生物堿的影響Fig.3 The effect of the ratio of sample weight to solvent volume on extraction of total alkaloids

由圖3可知，增加提取溶劑的比例，總生物堿的提取率逐漸增高，料液比1∶20(g/mL)時達(dá)最高，故料液比為1∶20(g/mL)較為合適。

2.2 微波加熱時間對提取總生物堿含量的影響

實驗條件同1.3節(jié)，考察微波加熱時間對總生物堿提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 微波加熱時間對提取總生物堿的影響Fig.4 The effect of microwave radiation time on extraction of total alkaloids

由圖4可知，微波加熱提取時間10 min時提取率最高，超過10 min，提取率反而降低。故選擇提取時間為10 min。

2.3 微波提取功率對提取總生物堿含量的影響

其他條件同1.3節(jié)，微波加熱提取時間為10 min，考察微波功率對提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 微波功率對提取總生物堿的影響Fig.5 The effect of microwave power on extraction of total alkaloids

由圖5可知，微波提取功率在500 W時牡丹雄蕊總生物堿提取率最高，功率過高提取率反而嚴(yán)重降低。故選擇微波功率500 W為宜。

2.4 乙醇濃度對提取總生物堿含量的影響

其他條件同1.3節(jié)，提取功率為500 W，考察乙醇濃度對提取率的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，增加乙醇的濃度可以提高總生物堿的提取率，但濃度超過70%以后，提取率有所下降。綜合考慮，乙醇濃度70%時最佳。

圖6 乙醇濃度對提取總生物堿的影響Fig.6 The effect of ethanol concentration on extraction of total alkaloids

2.5 浸潤時間對提取總生物堿含量的影響

分別準(zhǔn)確稱取牡丹雄蕊粉末2.5 g 5份，以料液比為1∶20，提取功率為500 W，乙醇濃度70%，選擇不同的浸潤時間 6，12，24，48，100 h 進行實驗，微波加熱提取時間為10 min，結(jié)果見圖7。

圖7 浸潤時間對提取總生物堿的影響Fig.7 The effect of soakage time on extraction of total alkaloids

由圖7可知，延長浸潤時間可以提高生物堿的提取率，但時間超過24 h以后，提取率反而會下降。綜合考慮，以浸潤時間24 h為最佳。

2.6 溶液pH值對提取總生物堿含量的影響

分別準(zhǔn)確稱取牡丹雄蕊粉末2.5 g 5份，微波加熱提取時間為10 min，料液比為1∶20，提取功率為500 W，乙醇濃度70%，浸潤時間為24 h，選擇不同的 pH 值 3.0，5.0，7.0，9.0 進行實驗，結(jié)果見圖 8。

圖8 pH值對提取總生物堿的影響Fig.8 The effect of pH value on extraction of total alkaloids

由圖8可知，增大pH值可以提高提取率，但pH值超過7.0以后，提取率下降，綜合考慮，pH值為7.0時最佳。

2.7 正交實驗

為了全面考察各因素對牡丹花雄蕊的提取效果，我們設(shè)計了6因素3水平的正交實驗，考察料液比、浸潤時間、微波加熱提取時間、微波功率、pH值和乙醇濃度對牡丹雄蕊中生物堿提取率的影響，因素水平安排和實驗結(jié)果見表1。

表1 正交實驗結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiments

由表1可知，6個因素對實驗結(jié)果影響大小依次是:料液比(A)＞浸潤時間(B)＞乙醇濃度(F)＞pH值(E)＞微波加熱提取時間(C)＞微波功率(D)，尤其是料液比(A)、浸潤時間(B)和乙醇濃度(F)這3個因素影響顯著。空白列的極差最小，表明沒有其它影響較為明顯的因素存在，本實驗考察的影響因素較為完全。

由表1可知，微波提取牡丹雄蕊總生物堿的最佳工藝條件為A3B2C3D2E1F3，即料液比1∶20，浸潤時間24 h，微波加熱提取時間 15 min，微波功率500 W，pH值3和乙醇濃度80%。

按照最佳工藝實驗條件進行實驗，得到總生物堿提取液的吸光度A值為0.164 5，優(yōu)于正交實驗中的任何一組實驗，換算成提取率為2.16%。因此，可以確定最優(yōu)方案。

3 結(jié)論

用微波法提取牡丹雄蕊中總生物堿的最佳提取工藝條件為:料液比1∶20，浸潤時間24 h，微波加熱提取時間15 min，微波功率500 W，pH值3和乙醇濃度80%，該工藝條件下，牡丹雄蕊中總生物堿提取率為2.16%。

［1］Wang Xiao，Cheng Chuange，Sun Qinglei，et al.Isolation and purification of four flavonoid constituents from the flowers of Paeonia suffruticosa by highspeed counter-current chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2005，1075:127-131.

［2］田貴林，趙貴紅.牡丹鮮花在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(4):187-190.

［3］郭香鳳，史國安.牡丹花水提液對氧自由基的清除作用［J］.植物生理學(xué)通訊，2004，40(1):37-38.

［4］鄧光輝，胡煒，劉榕城，等.溴麝香草酚藍(lán)比色法測定葉下珠生物堿的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(5):1193-1194.

［5］李宇亮，吳雅睿.荷葉總生物堿的提取與純化研究［J］.應(yīng)用化工，2007，36(1):4-6，14.

［6］李永春，葉新紅，舒翔，等.微波法提取苦豆子生物堿的研究［J］.中國食品添加劑，2008(5):75-76.