具有酪氨酸酶抑制作用的酵母多肽的分離純化及分子量分布

吳悅，劉學(xué)，唐蔚，曹光群

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫 214122)

酪氨酸酶是一種75 KDa含銅酶，來源于胚胎神經(jīng)鞘細(xì)胞，是黑色素代謝反應(yīng)的主要限速酶。近年來，天然短肽物質(zhì)因具有良好的酪氨酸酶活性抑制作用和很高的安全性而成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。Zhuang等［1］采用胰蛋白酶水解水母蛋白，分離純化后得到具有酪氨酸酶抑制活性的多肽(JCP)，其分子量分布為400～1 200 Da。Chen等［2］研究顯示，酸奶乳清中含有能較好抑制酪氨酸酶活性的多肽。酵母多肽是酵母蛋白經(jīng)生物酶解后分離純化得到的生物活性多肽，國內(nèi)對酵母多肽的研究主要集中在抗高血壓性、抗氧化性方面等［3-4］，有關(guān)酵母多肽的酪氨酸酶活性抑制作用研究相對較少。彭寧等［5］研究顯示，酵母提取物中含對酪氨酸酶和黑色素細(xì)胞具有抑制作用的活性物質(zhì)，指出具有抑制活性的物質(zhì)可能為多肽組分，可將其開發(fā)應(yīng)用于皮膚的美白護(hù)膚品中，但并未對具有酪氨酸酶抑制活性的成分作進(jìn)一步剖析。更未有研究涉及探究具有抑制酪氨酸酶抑制活性的酵母多肽的分子量分布。

本實驗以酪氨酸酶活性抑制率為檢測指標(biāo)，先將酵母多肽粗制品溶液(CPYP)進(jìn)行超濾，進(jìn)而比較不同分子量范圍的多肽對酪氨酸酶抑制活性的影響，再將抑制酪氨酸酶活性最高的組分依次采用DEAE-52 Cellulose陰離子柱層析法、Sephadex-15凝膠柱層析法分離，收集各洗脫組分并進(jìn)行活性檢測，確定具有最佳活性的洗脫組分。通過高效液相空間排阻色譜法(SEC-HPLC)測定酪氨酸酶抑制多肽的分子量分布。為酵母多肽在功能性食品及化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗依據(jù)，也為進(jìn)一步開發(fā)特定功能的酵母多肽奠定理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

CPYP，自制;酪氨酸酶、熊果苷均為生化試劑;DEAE-52陰離子纖維樹脂;G-15葡聚糖凝膠;酪氨酸、Tris、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純。

HH·S/1-1S數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋;R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵;LGJ-10真空冷凍干燥機(jī);Avanti J-E多用途高效離心機(jī);UF-101超濾系統(tǒng);AKTA蛋白質(zhì)分析儀;TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計;Waters600高效液相色譜儀。

1.2 酵母多肽的分離純化

1.2.1 超濾法 將CPYP依次通過截留分子量為10 KDa、5 KDa和1 KDa的超濾膜，分別獲得分子量處于 ＞10 KDa、5～10 KDa、1～5 KDa、＜1 KDa的4個組分(記為 YP1、YP2、YP3、YP4)。分別進(jìn)行冷凍干燥。取適量干燥物以去離子水配制成5 mg/mL的溶液，測定酪氨酸酶活性的抑制效果。

1.2.2 DEAE-52 Cellulose陰離子交換柱層析 根據(jù)1.2.1節(jié)實驗結(jié)果，取YP4樣品25 mg溶于5 mL Tris-HCl緩沖溶液 A(10 mmol/mL，pH 8.5)中，配制成濃度為5 mg/mL的溶液。用DEAE-52 Cellulose陰離子交換層析法進(jìn)一步分離純化。采用梯度洗脫方式:洗脫液B為含0.1～0.8 mol/L NaCl的緩沖液A，進(jìn)樣量為5 mL，流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm，收集各峰組分，并對各峰組分的抑制活性進(jìn)行比較。取抑制活性最高的峰組分冷凍干燥，備用。

1.2.3 Sephadex G-15凝膠柱層析 將Sephadex G-15凝膠在室溫下以蒸餾水溶脹24 h，裝柱，以超純水對凝膠層析柱進(jìn)行平衡。取1.2.2節(jié)中冷凍干燥樣品適量溶于超純水中，以0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 mL，以超純水進(jìn)行洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm，收集各峰組分，并檢測各峰組分對酪氨酸酶活性的抑制作用。取抑制活性最高的峰組分冷凍干燥，備用。

1.3 分析方法

1.3.1 SEC-HPLC測定相對分子質(zhì)量分布 冷凍干燥樣品溶于超純水中，采用高效液相空間排阻色譜法測定其分子量分布，條件如下:色譜柱為TSK gel 2000 SWXL(300 mm ×7.8 mm)，柱溫30 ℃，流動相乙腈/水/三氟乙酸 =45/55/0.1(體積比)，流速0.5 mL/min，檢測波長 220 nm。

以細(xì)胞色素 C(MW 12 500)、桿菌酶(MW 1 450)、乙 氨 酸-乙 氨 酸-酪 氨 酸-精 氨 酸(MW 451)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189)為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，作相對分子量校正曲線。

1.3.2 酪氨酸酶抑制活性測定［6］按表1中所列的各反應(yīng)液組分的體積以微量移液器依次準(zhǔn)確吸取磷酸緩沖液(pH=6.8)、樣品溶液及酪氨酸酶溶液(100 μg/mL)置于試管中。將試管置于恒溫水浴鍋中，37℃ 恒 溫 10min。分 別 加 入 0.5mL(8 mmol/L)L-酪氨酸，搖勻，繼續(xù)于37℃下恒溫反應(yīng)20 min。取出，將反應(yīng)液迅速移入比色皿中，在475 nm處測定吸光值ODA、ODB、ODC和ODD。進(jìn)行3次平行實驗，按下式計算樣品的酪氨酸酶抑制率(X)。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾法截留組分的酪氨酸酶抑制活性

CPYP經(jīng)超濾法得到的4個截留組分 YP1、YP2、YP3和YP4的酪氨酸酶抑制活性結(jié)果見表2。

表2 超濾法各截留組分的酪氨酸酶抑制率±s)Table 2 Tyrosinase inhibition ofultrafiltration fractions±s)

組分 抑制率/%YP1 25.39 ±1.5 YP2 30.25 ±2.7 YP3 41.67 ±3.68 YP4 58.17 ±2.1

由表2可知，各分子段截留組分的活性隨著相對分子質(zhì)量的減小而增大，相對分子質(zhì)量低于1 KDa的組分活性最高。這可能是因為隨著酵母蛋白被蛋白酶的逐步降解，肽段數(shù)量不斷增加，酵母多肽的相對分子質(zhì)量不斷下降，在一定范圍內(nèi)，其活性位點(diǎn)的暴露量不斷增加，從而使其活性也相應(yīng)的增加。

2.2 DEAE-52陰離子交換柱層析

YP4組分進(jìn)行纖維素DEAE-52陰離子柱交換層析色譜進(jìn)行分離，結(jié)果見圖1。

圖1 YP4組分的纖維素DEAE-52陰離子交換色譜圖Fig.1 Chromatogram of fraction YP4 by DEAE-52 anion exchange chromatography

由圖1可知，DEAE-52陰離子交換層析柱分離純化主要得到 a、b、c、d、e、f、g 7 個峰組分。分別收集各峰組分，除鹽后冷凍干燥為粉末。取各峰粉末溶解于去離子水中，配制成濃度為5 mg/mL的水溶液，分別測定其酪氨酸酶抑制效果，結(jié)果見圖2。

圖2 DEAE-52陰離子柱分離得到的各組分的酪氨酸酶抑制活性Fig.2 Tyrosinase inhibition of each fraction by DEAE-52 anion exchange chromatography

由圖2可知，峰組分d對酪氨酸酶的抑制活性最高，抑制率為65.9%(5 mg/mL)，且各洗脫峰的酪氨酸酶抑制率有明顯差異，說明纖維素DEAE-52陰離子交換層析柱對活性多肽有較好的分離作用。收集活性最高組分d并進(jìn)行濃縮和冷凍干燥，用于下一步分析。

2.3 Sephadex G-15凝膠柱層析

d組分多肽液以Sephadex G-15凝膠柱進(jìn)一步分離，分別收集各信號峰相應(yīng)的洗脫液(依次編號為 d-1、d-2、d-3、d-4)，色譜結(jié)果見圖3。

圖3 組分d的Sephadex G-15凝膠層析色譜圖Fig.3 Chromatogram of fraction d by Sephadex G-15 gel chromatography

將各組分分別濃縮并冷凍干燥，以去離子水配制成濃度為4 mg/mL的溶液，測定其對酪氨酸酶活性的抑制效果，結(jié)果見圖4。

圖4 Sephadex G-15凝膠層析得到的各組分的酪氨酸酶抑制活性Fig.4 Tyrosinase inhibition of each fraction by Sephadex G-15 gel chromatography

由圖4可知，d-1的酪氨酸酶抑制活性最高，抑制率為68.57%(4 mg/mL)，具有較高的酪氨酸酶抑制活性。多肽呈現(xiàn)一定的酪氨酸酶抑制作用，可能與其減緩氧化反應(yīng)進(jìn)程［7］和對酪氨酸酶活性中心的 Cu2+的綁定［8］有一定的關(guān)系。Cristina［9］指出，肽鏈的長度可能影響多肽對活性中心Cu2+的綁定，肽鏈太短，綁定不夠穩(wěn)定，而不利于多肽和酪氨酸酶的結(jié)合。d-1對酪氨酸酶具有較好抑制作用可能是由于組分d-1分子量較其他洗脫組分更大，肽鏈較長而更利于d-1和酪氨酸酶的結(jié)合所致。

2.4 分子量測定

采用TSKgel 2000 SWXL分析d-1組分中多肽的相對分子量分布，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量校正曲線回歸方程 logMW=6.724 －0.235 T，R2=0.991，d-1組分相對分子質(zhì)量分布見圖5。

由圖5可知，具有酪氨酸酶抑制活性的多肽分子量主要分布在200～800 Da。根據(jù)氨基酸平均分子量為128 Da，多肽組分為2～8個氨基酸組成的肽為主。多肽結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其酪氨酸酶抑制活性一方面可能與其特定氨基酸組成密切相關(guān);另一方面，還可能與其氨基酸組成序列有關(guān)。Marloes Schurink等［10］指出，具有較好酪氨酸酶抑制活性的多肽通常含由一個甚至多個精氨酸殘基和(或)苯丙氨酸殘基再連接纈氨酸、丙氨酸或亮氨酸等疏水性氨基酸組成。酵母活性肽的氨基酸組成及結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步探索。

圖5 d-1組分的HPLC分子量分布圖Fig.5 Molecular weight distribution profile of fraction d-1 by HPLC

2.5 酪氨酸酶抑制活性

分別取不同濃度的d-1和熊果苷溶液，測定對酪氨酸酶活性的抑制效果，結(jié)果見圖6。

圖6 d-1、熊果苷質(zhì)量濃度對酪氨酸酶活性的影響Fig.6 Effect of arbutin and fraction d-1 on tyrosinase activity

由圖6可知，在一定濃度范圍內(nèi)，組分d-1對酪氨酸酶表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且抑制率隨濃度的增加而逐漸升高，其IC50值為3.53 mg/mL。同樣，作為對照的高效酪氨酸酶抑制劑熊果苷，也表現(xiàn)出隨濃度的增加抑制率上升的趨勢。不同的是熊果苷單位濃度的抑制率高于 d-1組分，其 IC50值為0.22 mg/mL。研 究 顯 示［11］，熊 果 苷 濃 度 超 過250 μg/mL時，將呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，而酵母多肽被廣泛開發(fā)用于抗血壓食品中［12-13］，其安全性毋庸置疑。酵母多肽作為純天然酪氨酸酶抑制劑，有望開發(fā)作為美白化妝品添加劑，美白皮膚，同時起到減少皮膚刺激及補(bǔ)充皮膚營養(yǎng)的功效。

3 結(jié)論

實驗表明，分子量在1 KDa以內(nèi)的酵母多肽具有最高的酪氨酸酶抑制活性。YP4經(jīng)DEAE-52 Cellulose陰離子交換層析和Sephadex G-15凝膠層析分離純化后，分離出對酪氨酸酶具有較高抑制活性的組分d-1，其IC50值為 3.53 mg/mL，主要為相對分子質(zhì)量在200～800 Da范圍內(nèi)的多肽組分。酵母多肽的酪氨酸酶抑制機(jī)理和分離純化還有待進(jìn)一步研究。

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