基于生物燃料電池智能邏輯生物傳感器的研究進(jìn)展

趙靈芝，張小清，苗延青，鄧文婷，胡顥

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安 710021)

邏輯生物傳感器(LB)是以蛋白質(zhì)、DNA、酶以及整個(gè)活細(xì)胞為分子識(shí)別單元，通過生化反應(yīng)方式進(jìn)行信息輸入，通過布爾邏輯運(yùn)算對信息進(jìn)行處理和加工，然后輸出信息的裝置。與傳統(tǒng)生物傳感器不同，智能化的邏輯生物傳感器不是通過輸入信號和輸出信號一對一的定量響應(yīng)模式來實(shí)現(xiàn)檢測和分析的目的［1-3］，它可以在復(fù)雜體系中，通過布爾邏輯運(yùn)算向生物計(jì)算系統(tǒng)編程，從而同時(shí)反映多種目標(biāo)物的存在以及相互間的關(guān)系。生物燃料電池(BFC)是指以酶或微生物作為催化劑，通過生物電化學(xué)途徑將生物物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的裝置，其可作為自供電能源發(fā)展為植入式微型人工電子器件［4-7］。基于生物燃料電池發(fā)展的智能邏輯生物傳感器將兩者的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，可發(fā)展為智能化、微型化、不需外接電源的分析裝置，已初步應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測、診斷以及藥物的控釋研究中［8-11］。本文重點(diǎn)綜述近5年基于BFC發(fā)展的邏輯生物傳感器的工作原理和研究進(jìn)展［12-19］。

1 基于封閉效應(yīng)的自供電邏輯生物傳感器

基于封閉效應(yīng)發(fā)展的自供電邏輯生物傳感器，往往在BFC兩極修飾適配子或脫氧核酶等具有識(shí)別能力的生物大分子，在多種目標(biāo)物處于某種存在狀態(tài)時(shí)，它們在電極表面可自由伸展，不阻礙電極表面的電子傳遞;一旦目標(biāo)物達(dá)到特定的存在狀態(tài)時(shí)，適配子或脫氧核酶與相應(yīng)的目標(biāo)物結(jié)合，形成復(fù)合物，吸附于電極表面，從而使兩極電子傳遞受到不同程度的抑制，表現(xiàn)出BFC各電化學(xué)參數(shù)的變化。這種邏輯傳感器以幾種目標(biāo)物的存在狀態(tài)(如無目標(biāo)物存在、單一目標(biāo)物存在、目標(biāo)物均存在等)為輸入信號Input，以電池的電化學(xué)參數(shù)達(dá)到某一定值作為輸出信號Output，基于電極表面的封閉效應(yīng)來設(shè)計(jì)邏輯關(guān)系，從而構(gòu)建不同邏輯關(guān)系的自供電傳感器。2010年，董紹俊等［12］報(bào)道了首個(gè)基于封閉效應(yīng)適配子邏輯體系控制的生物燃料電池，并以此發(fā)展了自供電邏輯生物傳感器(見圖1)。電池兩極均以氧化銦錫為基底電極，陽極通過自組裝膜將葡萄糖氧化酶(GOD)和凝血酶適配子(TBA)修飾于電極表面;陰極以同樣的方式，將膽紅素氧化酶(BOD)和溶解酵素適配子(LBA)修飾于電極表面;整個(gè)電池是以葡萄糖為燃料，以羧酸二茂鐵(FMCA)為兩極的電子介體，通過陽極GOD催化葡萄糖氧化和陰極BOD催化O2還原產(chǎn)生輸出電流。當(dāng)凝血酶存在、溶解酵素不存在于體系中時(shí)，即輸入信號Input(1，0)，陽極TBA可特異性結(jié)合凝血酶，形成蛋白復(fù)合物，封閉了電極表面，從而阻礙電極表面電子傳遞，使GOD催化葡萄糖氧化產(chǎn)生過電位，降低電池的開路電位;凝血酶的存在并沒有影響陰極的電化學(xué)反應(yīng)，從而沒有造成電池開路電位大幅度下降，即輸出信號 Output 1(開路電位 ＞0.05 V為 Output 1，＜0.05 V為Output 0);同樣當(dāng)體系中存在目標(biāo)物溶解酵素而不存在凝血酶時(shí)，即Input(0，1)，也不會(huì)使電池開路電位的大幅度下降;只有當(dāng)目標(biāo)物凝血酶和溶解酵素均存在于體系中時(shí)，即Input(1，1)，由于蛋白復(fù)合物封閉了兩極造成電池開路電位的大幅度下降，即Output 0;也就是當(dāng)體系處于Input(0，0)、Input(1，0)和 Input(0，1)3 種狀態(tài)下，Output均為1;只有體系處于 Input(1，1)，Output為0。董紹俊組首次提出適配子與生物燃料電池之間的“互惠”概念，即基于適配子的邏輯生物信號作為控制生物燃料電池能量的輸出及生物燃料電池作為適配子的傳感器。相對于傳統(tǒng)傳感器，這個(gè)體系的特征對應(yīng)于“與非”邏輯門，可用于分析在單一體系中兩種目標(biāo)物是否同時(shí)存在，并可智能化檢測復(fù)雜樣品中各種物質(zhì)間的關(guān)系。隨后，他們組［13］基于封閉效應(yīng)發(fā)展了適配子具有重置功能的自供電式傳感器，整個(gè)裝置通過生物物質(zhì)作為輸入信號，通過簡單的處理方式可使體系重置來達(dá)到多次使用的目的，并成功應(yīng)用于智能化檢測人血清中凝血酶和ATP。但這個(gè)裝置的不足之處在于BFC較低的輸出電壓和功率，限制了裝置的實(shí)際應(yīng)用，或可通過電池兩極電子介體的選擇和改進(jìn)來完善這一裝置。

圖1 模仿布爾“與非”邏輯門的適配子邏輯體系控制的生物燃料電池示意圖［12］Fig.1 Schematic illustration of the assembled aptamer-based BFC logically controlled by biochemical signals that mimicks a boolean NAND logic gate

Katz等［14］基于封閉效應(yīng)，發(fā)展了自供電生物分 子鍵盤鎖安全系統(tǒng)(見圖2)，電池陽極設(shè)計(jì)了3個(gè)連鎖的酶催化反應(yīng)，最終將燃料葡萄糖氧化為葡萄糖酸，從而使整個(gè)體系pH從最初6.7降至4.2，電池陰極表面修飾了聚-4-乙烯基吡啶(P4VP)，當(dāng)體系pH＞5.5時(shí)，聚合物P4VP呈現(xiàn)疏水收縮狀態(tài)封閉電極表面，阻礙電子介體鐵氰化鉀［Fe(CN)6］3－在電極表面的電子傳遞，即Output 0;當(dāng)體系pH＜4.5時(shí)，聚合物P4VP的吡啶基發(fā)生質(zhì)子化呈現(xiàn)帶正電的親水溶脹狀態(tài)，不再阻礙電子介體在電極表面的電子傳遞，從而使BFC兩極構(gòu)成回路，有最大輸出功率即Output 1;這個(gè)邏輯體系的輸入信號設(shè)計(jì)在電池陽極，以3個(gè)連鎖化學(xué)反應(yīng)的催化劑酶為Input A、Input B和Input C，體系只有當(dāng)3種酶依次出現(xiàn)A-B-C，并逐個(gè)完成催化反應(yīng)，才能使體系pH降至4.5以下;其他5種輸入信號C-B-A、A-C-B、B-CA、B-A-C、C-A-B，因陰極沒有電子傳遞，無功率輸出，即Output 0。這個(gè)多酶控制的鍵盤鎖安全系統(tǒng)以生物分子酶的正確排列為輸入密碼，以電池有最大功率輸出為正確通過狀態(tài)，可用于構(gòu)建生物計(jì)算機(jī)的密碼驗(yàn)證安全系統(tǒng);另一方面，也可作為自供電邏輯傳感器用于智能化分析體內(nèi)多種酶及其相互間的關(guān)系研究。

圖2 基于pH控制的生物燃料電池發(fā)展的鍵盤鎖安全系統(tǒng)原理示意圖［14］Fig.2 The pH-switchable biofuel cell for“reading”the output signals generated by the keypad lock system

2 基于底物效應(yīng)的自供電邏輯生物傳感器

由于酶型BFC以酶的底物作為電池兩極的生物燃料，所以電池的電化學(xué)參數(shù)均與多種底物的存在狀態(tài)呈現(xiàn)某種邏輯關(guān)系，而自供電邏輯生物傳感器大都通過輸出電流，或開路電位以及輸出功率等這些電化學(xué)參數(shù)達(dá)到某一定值作為輸出信號Output，基于此，研究者可設(shè)計(jì)多種底物關(guān)系控制的邏輯體系，并以此發(fā)展基于BFC的自供電式邏輯傳感器。董紹俊組［15］基于底物O2控制的BFC，發(fā)展了酶邏輯體系控制的傳感系統(tǒng)(見圖3)，電池陽極通過GOD催化葡萄糖氧化，陰極通過BOD催化O2還原來構(gòu)成回路輸出電流，分別以羧酸二茂鐵FMCA和 2，2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)(ABTS)為電子介體;O2作為陰極BOD的底物即陰極的燃料，其濃度的增加可促使電池陰極還原電流增大，而O2作為陽極GOD催化葡萄糖氧化的電子受體，其與電子介體FMCA屬于競爭關(guān)系，隨著O2濃度的增加，電池陽極氧化電流減小;所以當(dāng)體系中O2濃度達(dá)到適中值，即空氣飽和狀態(tài)(O2達(dá)21%)時(shí)，電池有最大功率輸出，O2濃度達(dá)到極高值或極低值均能影響電池功率的輸出。整個(gè)邏輯體系以通入O2和通入N2作為Input A和 Input B，構(gòu)建了“與”門和“非”門邏輯體系控制的BFC，并成功應(yīng)用于體液中溶解O2的檢測。隨后，董紹俊組［16］以底物O2作為邏輯體系輸入信號，為模擬體內(nèi)血液流動(dòng)的動(dòng)態(tài)過程，將攪拌溶液作為另一個(gè)輸入信號，建立了能同時(shí)檢測血液中含氧量以及判斷血流是否通暢的自供電邏輯傳感裝置。此類氣體控制的邏輯傳感器具有以下優(yōu)勢:其一，以氣體作為輸入信號控制整個(gè)體系，操作更方便;其二，利用通入不同氣體來改變體系的初始態(tài)，從而快速簡易地實(shí)現(xiàn)兩種邏輯門體系間的轉(zhuǎn)換;其三，基于無隔膜單極室的BFC，將兩極催化劑酶固定在電極上，反應(yīng)所需酶的量很少，并可發(fā)展作為一體化的裝置應(yīng)用于在醫(yī)學(xué)診斷中。

圖3 空氣、氧氣、氮?dú)庥绊懮锶剂想姵剌敵龉β实淖饔脵C(jī)制［15］Fig.3 Effect of air，O2，or N2on the power output of the BFC based on GOD/OMCs-FMCA-bioanode and BOD/OMCs-ABTS-biocathode

Zhou等［17］基于底物效應(yīng)，將BFC技術(shù)與生物邏輯體系結(jié)合，發(fā)展了集病理性生物標(biāo)志物檢測、病情診斷、藥物控釋為一體的自供電智能應(yīng)答體系，將其應(yīng)用于腹外傷病理模型中藥物的控釋研究。電池陽極通過乳酸脫氫酶(LDH)催化乳酸(LA)氧化，陰極通過O2的還原輸出電流，將LDH和LA作為Input A和Input B。研究者巧妙地在電池陰極固定包載藥物乙酰胺酚的導(dǎo)電聚合物，當(dāng)體系處于以下3種狀態(tài) Input(0，0)、Input(0，1)、Input(1，0)時(shí)，即LDH和LA都不存在或僅存在一種，這代表正常的生理狀態(tài)，整個(gè)電池體系均無輸出電流，即Output 0，從而藥物依然包載于導(dǎo)電聚合物中;只有當(dāng)體系處于Input(1，1)，即LDH和LA都存在，這代表缺血缺氧等病理狀態(tài)，電池電路才有電流的輸出Output 1，從而導(dǎo)致導(dǎo)電聚合物將包載藥物釋放到體系中。這個(gè)體系通過陽極內(nèi)置的邏輯體系控制BFC的功率輸出，可進(jìn)一步應(yīng)用于醫(yī)療保健和臨床診斷相關(guān)的智能化藥物釋放體系中，但體系仍存在一些需要改進(jìn)的地方，如增強(qiáng)邏輯體系的診斷能力、減少復(fù)雜體系的干擾、增大BFC輸出功率等。

Wang等［18］基于底物效應(yīng)發(fā)展了脫氧核酶邏輯體系控制的生物燃料電池，并以此發(fā)展了自供電邏輯生物傳感器，體系特征對應(yīng)于“抑制”門，可用于反映病理環(huán)境中多種目標(biāo)物間的抑制關(guān)系。此項(xiàng)研究的創(chuàng)新之處在于將DNAzymes活性用于邏輯關(guān)系的構(gòu)建，伴隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，多種底物的DNAzymes均很容易得到，所以可進(jìn)一步發(fā)展為反映生理環(huán)境中多種具有DNAzymes的目標(biāo)物(如凝血酶、溶解酵素、K+等)之間關(guān)系的邏輯生物傳感體系。

3 基于基因調(diào)控的自供電邏輯生物傳感器

Angenent等［19］報(bào)道了基因調(diào)控邏輯體系控制的微生物燃料電池(MFC)，以此發(fā)展了自供電“與”門生物傳感器。是以綠膿桿菌lasI/rhlI基因片段調(diào)控的兩種高絲氨酸內(nèi)酯作為Input A和Input B，當(dāng)兩者同時(shí)存在于體系，即Input(1，1)，啟動(dòng)菌群密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控體系產(chǎn)生電活性吩嗪，從而使MFC有最大電流的輸出Output 1。細(xì)菌代謝反應(yīng)涉及到復(fù)雜的基因調(diào)控和蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究者利用其中一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系發(fā)展的邏輯生物傳感器，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)控致病菌群的變異和感染情況。此外，相信基于MFC發(fā)展的邏輯傳感器，可通過菌群種類和菌群涉及的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系的選擇，進(jìn)一步應(yīng)用于智能化控制污水處理和發(fā)酵等工作。

4 結(jié)束語

自2010年首個(gè)適配子邏輯體系控制的生物燃料電池構(gòu)建以來，研究者們將生物邏輯體系與生物燃料電池的優(yōu)勢相結(jié)合，基于不同效應(yīng)構(gòu)建了多種功能性的邏輯生物傳感器，普遍具有智能化、微型化、裝置一體化、不需要外接電源等優(yōu)點(diǎn)，已初步應(yīng)用于反映多種目標(biāo)物的存在以及智能化檢測復(fù)雜樣品中各物質(zhì)間的關(guān)系。這種智能化的傳感器屬于生物計(jì)算領(lǐng)域，是以生物分子作為輸入信號，所以可以基于多種生化反應(yīng)來構(gòu)建不同的邏輯體系。但同時(shí)也存在著一些局限，此類智能傳感器研究的生理活性物質(zhì)往往不是臨床醫(yī)學(xué)中關(guān)鍵的生物標(biāo)志物，也尚不能適用于反映特殊環(huán)境下(如生理、病理等)的多種目標(biāo)物，仍需進(jìn)一步合理設(shè)計(jì)傳感器的邏輯體系，尋找適宜的生化反應(yīng)，并以此構(gòu)建重要生物標(biāo)志物的邏輯智能體系，或許生物體復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)是解決這一問題的可靠途徑。此外，生物燃料電池較低的輸出電壓和功率，也限制了這種自供電裝置的實(shí)際應(yīng)用，研究者或可通過改進(jìn)電池兩極電子介體和兩極物質(zhì)的固定方式來完善這一問題。最終將這種基于生物燃料電池發(fā)展的智能邏輯生物傳感器廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)檢測和診斷以及多種病理環(huán)境下藥物的控釋中。

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