雙黃連粉針及其活性成分對大鼠細(xì)胞色素P450酶的體外抑制作用*

代晶,王麗聰,吳丹,涂碎萍,仇麗穎

(1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,成都 610083;2.西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院,成都 610041)

雙黃連粉針及其活性成分對大鼠細(xì)胞色素P450酶的體外抑制作用*

代晶1,王麗聰1,吳丹1,涂碎萍1,仇麗穎2

(1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,成都 610083;2.西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院,成都 610041)

目的 考察雙黃連粉針及其7種主要活性成分對大鼠肝微粒中細(xì)胞色素P450酶(CYP)1A、CYP2D和CYP3A酶的體外抑制作用。方法將CYP1A、CYP2D和CYP3A的探針底物(非那西丁、右美沙芬、咪達唑侖)分別與雙黃連粉針及其7種活性成分(黃芩苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、綠原酸、咖啡酸、木樨草苷)在大鼠肝微粒中進行孵育反應(yīng),采用高效液相色譜(HPLC)法同時測定3種探針底物的含量,評價底物的代謝率是否被抑制。結(jié)果與空白對照組比較,雙黃連粉針和黃芩苷對CYP2D和CYP3A有抑制作用,對CYP1A無影響;其他活性成分對三種酶無影響。結(jié)論雙黃連粉針在與CYP2D和CYP3A底物合用時可能產(chǎn)生相互作用,黃芩苷可能是這種作用的主要效應(yīng)物質(zhì)。

雙黃連粉針;黃芩苷;細(xì)胞色素P450;抑制作用

細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP)是生物體內(nèi)重要的混合功能氧化酶,參與80%以上的藥物代謝[1-2],并在藥物相互作用中扮演重要角色,通過對藥物-CYP的分析研究,可以指導(dǎo)臨床安全有效地使用藥物。雙黃連是治療細(xì)菌和病毒感染的較好制劑[3],在臨床治療中,常與其他藥物聯(lián)合使用。在與某些藥物合用或按不同配方使用時,雙黃連中有效成分的藥動學(xué)發(fā)生改變[4-6],這提示雙黃連與這些物質(zhì)存在相互作用。鑒于CYP在藥物研究中的重要地位,為提高雙黃連粉針的用藥安全,有必要研究雙黃連粉針及其活性成分對CYP的影響。筆者在本實驗以非那西丁、右美沙芬、咪達唑侖為探針底物,通過高效液相色譜(HPLC)法,研究雙黃連粉針及其7種主要活性成分(黃芩苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、綠原酸、咖啡酸、木樨草苷)對大鼠體外肝微粒體中CYP1A、CYP2D、CYP3A酶的影響,以期為雙黃連粉針?biāo)幬锵嗷プ饔玫脑缙陬A(yù)測、避免不良反應(yīng)和毒副作用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley, SD)大鼠10只,♂,8周齡,體質(zhì)量(250±20)g,由成都達碩生物科技有限公司提供,合格證號:SCXK(川) 2013-24。飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院科研中心SPF級屏障系統(tǒng)動物實驗室,使用許可證號:SYXK(川)2009-125,溫度20～40℃,相對濕度(40～60)%,噪度＜60 dB。

1.2 試藥 非那西丁、阿普唑侖、氫溴酸右美沙芬、咪達唑侖、綠原酸對照品均購自中國食品藥品檢定研究院,批號依次為100095-198904,171218-200603, 100201-201003,171250-200401,110753-200413,純度＞98%。連翹苷、蘆丁、黃芩苷、木樨草苷、咖啡酸對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司,批號依次為11080301,11040302,11101403,12041703,10112201,純度＞98%。連翹酯苷A購自四川省維克奇生物科技有限公司,批號:120328,純度＞98%。雙黃連粉針購自哈藥集團中藥二廠,批號:1104210,規(guī)格:每瓶600 mg。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)購自美國Los Angeles公司,純度＞97%,批號:091467。甲醇和乙腈為色譜純試劑,其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 Ultimate3000型高效液相色譜儀(美國Dionex公司),Biofuge stratos臺式高速離心機(美國Thermo公司)。

1.4 溶液配制 分別取非那西丁、氫溴酸右美沙芬、咪達唑侖對照品適量,用甲醇稀釋配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中非那西丁溶液的濃度分別為1 000,500,200,100, 50,20,10,5 μmol·L-1;氫溴酸右美沙芬溶液的濃度為100,50,20,10,5,2,1,0.5 μmol·L-1;咪達唑侖的濃度為200,100,50,20,10,5,2,1 μmol·L-1。另取阿普唑侖(內(nèi)標(biāo))對照品適量,用甲醇稀釋配制濃度為50 mg·L-1。取雙黃連粉針、黃芩苷、連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、綠原酸、咖啡酸適量加甲醇配制成100 mg·L-1的溶液。取木樨草苷適量加甲醇配制成40 mg·L-1的溶液。取Tris和氯化鎂(MgCl2)適量,加水配成濃度分別為0.1 mol·L-1和0.04 mol·L-1的溶液,用鹽酸調(diào)pH為7.4,制備成Tris緩沖液。上述溶液置4℃冰箱備用。

1.5 肝微粒體的制備與測定 參照文獻[7]方法,制備大鼠肝微粒體,測定其蛋白濃度。

1.6 孵育條件及樣品處理 取非那西丁、氫溴酸右美沙芬和咪達唑侖對照品溶液適量,再分別取雙黃連粉針及其7種活性成分溶液適量,上述溶液混合后揮干溶劑,加入肝微粒體溶液和Tris緩沖液,于37℃加入NADPH啟動反應(yīng)。此時,反應(yīng)體系終體積為0.5 mL,肝微粒體蛋白終濃度為1 g·L-1,NADPH終濃度為1 mmol·L-1;非那西丁、氫溴酸右美沙芬和咪達唑侖的終濃度分別為50.0,5.0,10.0 μmol·L-1;雙黃連粉針及其7種活性成分的終濃度為100或10 mg·L-1。 30 min后,將反應(yīng)樣品迅速置于冰浴中,并立即加入乙腈2.0 mL和內(nèi)標(biāo)溶液50 μL終止反應(yīng),渦旋混勻3 min,13 362×g離心10 min,取出上清液于45℃揮干溶劑。殘留物用流動相200 μL溶解,渦旋1 min后,16 911×g離心10 min,取出上清液40 μL進樣分析。按下式計算各探針底物的代謝消除率[8]。

探針底物代謝消除率(%)=(加入探針底物的量-測得探針底物的量)/加入探針底物的量×100%。

1.7 色譜條件 色譜柱為Chromsil C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈-0.01 moL·L-1磷酸氫二鉀(含0.5%三乙胺,鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.50±0.02)= 40∶60,體積流量為1 mL·min-1,柱溫為30℃。非那西丁、氫溴酸右美沙芬、咪達唑侖和阿普唑侖的檢測波長分別為254,202,220,220 nm。進樣體積為40 μL。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 專屬性實驗 取大鼠的空白肝微粒體溶液、空白肝微粒體加各探針底物和內(nèi)標(biāo)溶液,探針底物肝微粒體孵育30 min后的樣品溶液,按“1.6”和“1.7”項方法進行處理和測定。測定結(jié)果見圖1,在此條件下,各探針?biāo)幬镞_基線分離,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。

2.2 線性關(guān)系及定量限 精密量取探針底物系列對照品溶液各50 μL,揮干溶劑加入肝微粒體溶液和Tris緩沖液制備系列濃度的質(zhì)控樣品,其終體積是0.5 mL,蛋白終濃度是1 g·L-1,非那西丁、氫溴酸右美沙芬、咪達唑侖的終濃度分別為0.50～100.00 μmol·L-1,0.05～10.00 μmol·L-1,0.10～0.20 μmol·L-1。按“1.6”和“1.7”項方法進行處理和測定(n=3)。以底物濃度為橫坐標(biāo),底物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)進行線性回歸,同時以信噪比≥10計算定量下限。結(jié)果顯示:非那西丁、氫溴酸右美沙芬、咪達唑侖分別在0.50～100.00 μmol·L-1,0.05～10.00 μmol·L-1,0.10～20 μmol·L-1線性關(guān)系良好,對應(yīng)的回歸方程分別為Y= 0.024 4X+0.010 9(r=0.999 3),Y=0.071 4X-0.007 2 (r=0.999 5),Y=0.091 0X-0.008 0(r=0.999 8)。定量下限依次為0.05,0.05,0.10 μmol·L-1。

2.3 精密度實驗和回收率實驗 精密量取探針底物對照品溶液適量,制備低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品溶液,每個濃度一式6份。按“1.6”和“1.7”項方法在1 d內(nèi)進樣分析,計算日內(nèi)精密度,連續(xù)測定3 d,計算日間精密度。將測得的底物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入回歸方程,計算方法回收率。取同等濃度的各底物和內(nèi)標(biāo)的對照品溶液,直接揮干溶劑,流動相溶解后進樣分析,將樣品中各底物的峰面積與對照品峰面積進行比較,計算提取回收率,結(jié)果見表1。

2.4 穩(wěn)定性實驗 參照“2.3”項方法,制備低、中、高濃度質(zhì)控樣品溶液,分別置于室溫和-20℃冰箱中。置于室溫的樣品分別于24和48 h后進行測定,結(jié)果RSD＜6.2%。置于-20℃冰箱中的樣品分別于3和7 d后測定,結(jié)果RSD＜10.5%。表明各探針底物在室溫48 h內(nèi)穩(wěn)定,在-20℃冰箱7 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 雙黃連粉針及其7種活性成分對CYP1A、2D、3A影響 按照建立的方法,測定CYP1A、CYP2D、CYP3A底物在各給藥組中的代謝消除率,并與空白對照組比較。結(jié)果(表2)顯示,與空白對照組相比,雙黃連粉針和黃芩苷對CYP2D有抑制作用,在高濃度時對CYP3A有抑制作用,對CYP1A無影響;而連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁、綠原酸、咖啡酸和木樨草苷對這3種酶均無影響。

3 討論

3.1 底物的選擇 有學(xué)者以奧美拉唑為底物,考察雙黃連注射液對CYP的影響,但該底物具有交叉性,由多個CYP亞型酶共同代謝,故未能明確指出雙黃連注射液對哪種酶有影響[9]。非那西丁、氫溴酸右美沙芬和咪達唑侖分別是CYP1A、CYP2D和CYP3A的專屬性底物,常作為探針測定上述酶的活性。本實驗選擇這3種底物考察雙黃連粉針對CYP的影響,實驗所得的結(jié)果更有針對性。

3.2 雙黃連粉針的影響 本實驗結(jié)果顯示雙黃連粉針對非那西丁的代謝無影響,對氫溴酸右美沙芬有抑制作用,在高濃度時對咪達唑侖有抑制作用。這提示雙黃連粉針在與CYP1A底物聯(lián)合用藥時不會產(chǎn)生藥物相互作用,而與CYP2D和CYP3A底物可能產(chǎn)生相互作用。研究顯示,CYP3A和CYP2D底物眾多,約有50%和30%臨床藥物是CYP3A和CYP2D的底物[2],這意味著雙黃連粉針可能與很多藥物都有相互作用。鑒于雙黃連粉針對CYP2D和CYP3A的影響與其濃度相關(guān)的特點,建議雙黃連粉針在與上述酶底物在聯(lián)合用藥時,應(yīng)該考慮適當(dāng)調(diào)整給藥劑量或給藥間隔時間,避免產(chǎn)生不良反應(yīng)。

A.空白肝微粒體;B.含對照品的肝微粒體;C.孵育30 min后的肝微粒體;1.非那西丁;2.阿普唑侖;3.氫溴酸右美沙芬;4.咪達唑侖圖1 3種肝微粒HPLC圖A.blank liver micrsome;B.liver microsome spiked with reference substances;C.substrates incubated in liver microsome after 30min;1. phenacetin;2.alprazolam;3.dextromethorphan;4.midazolamFig.1 HPLC chromatographs of three types of liver micrsome

表1 探針底物精密度和回收率實驗結(jié)果Tab.1 Precision and recovery of the probe substrates ±s

表1 探針底物精密度和回收率實驗結(jié)果Tab.1 Precision and recovery of the probe substrates ±s

藥物份數(shù)加入量/ (μmol·L-1)精密度RSD/%回收率/%方法回收率提取回收率非那西丁日內(nèi)日間1.03.854.72 92.3±3.5 95.6±3.4 610.01.564.81 94.7±1.5 94.4±0.8 650.02.063.80 105.6±2.2 96.4±2.6氫溴酸右美沙芬60.212.7513.44 97.2±11.6 96.3±13.8 6 1.01.2710.63 97.8±1.3 95.2±1.4 6 5.02.0113.46 99.4±2.0 98.8±1.1咪達唑侖60.21.953.26 93.2±1.8 99.3±2.2 6 2.02.482.42 102.3±2.5 96.1±2.5 6 6 10.01.063.42 99.0±1.1 98.9±1.2

表2 各種成分對肝微粒體CYP1A、2D、3A底物代謝消除率的影響Tab.2 Effect of each constituent on metabolic rate of CYP1A、2D、3A substrates in liver microsome %,±s,n=3

表2 各種成分對肝微粒體CYP1A、2D、3A底物代謝消除率的影響Tab.2 Effect of each constituent on metabolic rate of CYP1A、2D、3A substrates in liver microsome %,±s,n=3

與空白對照組比較,CYP2D,F=17.905;CYP3A,F=25.167;*1P＜0.05;*2P＜0.01Compared with control group CYP2D,F=17.905;CYP3A,F=25.167;*1P＜0.05;*2P＜0.01

CYP1ACYP2DCYP3A空白對照組藥物濃度/(mg·L-1) 9.32±1.0349.55±4.5180.54±5.39雙黃連粉針108.81±1.9337.50±2.02*1*274.50±3.20 1009.13±2.3234.39±3.61*257.65±3.20*2黃芩苷109.51±2.0941.98±1.99*174.08±3.38 1009.57±1.2228.51±2.07*255.24±1.70*2連翹苷109.33±1.9348.40±2.2580.38±4.53連翹酯苷A109.77±2.4951.23±2.7783.27±2.97蘆丁109.05±1.3853.88±5.1280.84±1.02綠原酸108.56±2.7551.56±1.0481.73±3.04咖啡酸109.95±2.2246.99±6.0784.92±3.61木樨草苷0 108.28±1.4549.67±1.6279.45±0.96

3.3 活性成分的影響 黃芩苷在雙黃連粉針中的含量最高,其次為綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷,而咖啡酸、木樨草苷的含量則較少[10-13]。雙黃連粉針靜脈注射后,在體內(nèi)迅速消除,各成分中只有黃芩苷的血藥濃度能夠達到100 mg·L-1,其他成分很難達到10 mg·L-1[14-16]。本實驗根據(jù)各成分在雙黃連粉針中相對含量和體內(nèi)實驗結(jié)果,將黃芩苷的孵育終濃度設(shè)定100和10 mg·L-1,其他成分為10 mg·L-1,以此考察在一般給藥劑量下各成分的影響。實驗結(jié)果顯示,在上述濃度下,只有高濃度黃芩苷對CYP2D和CYP3A有影響,該結(jié)果與雙黃連粉針一致。這表明在正常使用劑量下,黃芩苷可能是雙黃連粉針與CYP相互作用的主要效應(yīng)物質(zhì)。然而雙黃連粉針作為復(fù)方中藥,其發(fā)揮作用的基礎(chǔ)是活性物質(zhì)群經(jīng)多途徑的整合而發(fā)揮其效應(yīng),雖然實驗結(jié)果顯示其他6種成分作為單體未能對CYP有影響,但其在體內(nèi)是否對雙黃連粉針和黃芩苷的效應(yīng)有協(xié)同作用,尚需進一步深入研究。

[1] CUPP M J,TRACY T S.Cytochrome P450:new nomenclature and clinical implications[J].Am Fam Physician,1998,57 (1):107-116.

[2] MARCELLA M,GENY G M M,RUBEN DE K.Species differences between mouse,rat,dog,monkey and human CYP-mediated drug metabolism,inhibition and induction [J].Exp Opin Drug Metab Toxicol,2006,2(6):875-894.

[3] 謝子任.雙黃連粉針劑的組分及藥用價值[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,6(32):146-147.

[4] 曾凡林,崔紅花,沈志濱,等.地塞米松對注射用雙黃連中綠原酸在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)影響[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2010,25(1):45-48.

[5] DI B,FENG N P,LIU W Y.Pharmacokinetic comparisons ofshuang-huang-lianwith the different combinations of its constitutional herbs[J].J Ethnopharmacol,2006,107(3): 401-405.

[6] 李朝霞,倪健,方冠南,等.黃芩苷對綠原酸在家兔體內(nèi)藥動學(xué)的影響[J].中國中藥雜志,2010,35(24):3291-3293.

[7] 代晶,楊萬清,廖林川.氯胺酮多次給藥對大鼠肝微粒體內(nèi)細(xì)胞色素P450-2B酶的誘導(dǎo)作用[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,7(3):383-385.

[8] 韋靈玉,張玉杰,魏寶紅,等.黃連黃芩及配伍誘導(dǎo)對大鼠肝微粒體5種CYP亞酶活性的影響[J].中國中藥雜志,2013,38(9):1426-1429.

[9] 于偉凡.雙黃連注射液對大鼠CYP的影響[D].鄭州:鄭州大學(xué),2009:1-22.

[10] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:846-848.

[11] 卞婷婷,安益強,湯道權(quán),等.HPLC法同時測定雙黃連凍干粉中11種成分的含量[J].藥物分析雜志,2012,32 (1):52-56.

[12] 孫永慧,李文春.HPLC同時測定雙黃連粉針劑中5種成分的含量[J].中成藥,2010,32(1):65-69.

[13] 黃蓓蓓,賀帥.微乳液相色譜法同時測定注射用雙黃連凍干粉中三組分的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,32(1): 92-95.

[14] YE J,SONG X W,LIU Z H,et al.Development of an LC-MS method for determination of three active constituents ofshuang-huang-lianinjectioninratplasmaandits application to the drug interaction study of Shuang-huanglianfreeze-driedpowdercombinedwithlevofloxacin injection[J].J Chromatogr B,2012,898(12):130-135.

[15] 周雪玲,孔雪姣,袁穎琳,等.注射用雙黃連粉針在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19 (24):168-171.

[16] 李秋紅,劉佩莉,馮宇飛.雙黃連粉針不同劑量給藥后黃芩苷的藥動學(xué)及唾液中的分布[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2009,26(1):3-5.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.004

In Vitro Inhibition of Cytochrome P450in Rats Liver Microsomes by Shuanghuanglian Injection Powder and Its Active Components

DAI Jing1,WANG Li-cong1,WU Dan1,TU Sui-ping1,QIU Li-ying2
(1.School of Pharmacy,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China;2.College of Chemistry and Environment Protection Engineering,Southwest University of Nationality,Chengdu 610041,China)

ObjectiveTo evaluate the inhibition effects ofshuanghuanglianinjection powder and its active components on the activities of CYP1A,CYP 2D and CYP 3A in rats liver microsomes.MethodsThree probe substrates including phenacetin for CYP1A,dextromethorphan for CYP2D and midazolam for CYP3A were incubated withshuanghuanglianinjection powder and the active components(baicalin,phillyrin,forsythiaside A,lutin,chlorogenic acid,coffeic acid and lutiolin)in rat liver microsomes.Contents of three probe substrates were simultaneously determined by HPLC to evaluate the metabolic rates.ResultsShuanghuanglianinjection powder and baicalin inhibited the activities of CYP2D and CYP 3A,but didn't affect CYP1A.The other active components showed no effect on CYP1A,CYP2D and CYP3A.ConclusionDrug-drug interactions may occur when combiningshuanghuanglianpowder injection with CYP2D and CYP 3A substrates and baicalin may be the effector substance responsible for the interactions.

Shuanghuanglianinjection powder;Baicalin;Cytochrome P450;Inhibition

R286;R965

A

1004-0781(2014)10-1269-05

2014-02-19

2014-03-31

*國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(20133705006);四川省教育廳理科重點項目(12ZA026)

代晶(1979-),女,吉林吉林人,講師,博士,研究方向:藥物代謝與藥動學(xué)。電話:028-62308639,E-mail:daijing320@126.com。

仇麗穎(1980-),女,遼寧錦州人,講師,博士,研究方向:生物藥物分析與藥品質(zhì)量控制。電話:028-85522315,E-mail:qiu7992@sina.com。