姜辣素對小鼠B16細胞黑素合成的影響*

神芳麗,霍仕霞

(1.新疆銀朵蘭維藥股份有限公司,烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所,新疆維吾爾醫方劑學實驗室,烏魯木齊 830049)

姜辣素對小鼠B16細胞黑素合成的影響*

神芳麗1,霍仕霞2

(1.新疆銀朵蘭維藥股份有限公司,烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所,新疆維吾爾醫方劑學實驗室,烏魯木齊 830049)

目的 探討姜辣素對小鼠B16細胞黑素合成的影響。方法黑素瘤細胞分別加入12.5,25.0,50.0, 100.0,200.0 μmol·L-1姜辣素和陽性對照藥物氫醌培養,達爾伯克改良伊格爾培養液(DMEM)作為空白對照組。采用四噻唑藍(MTT)比色法測定細胞增殖,比色法測定酪氨酸酶活性和黑素含量。結果與空白對照組比較,含姜辣素的給藥組均能夠明顯抑制小鼠B16細胞增殖(P＜0.05或P＜0.01),且濃度為200.0 μmol·L-1時,抑制率＞48%。與空白對照組比較,各濃度姜辣素均能夠顯著降低酪氨酸酶活性(P＜0.05或P＜0.01),姜辣素的濃度為200.0 μmol·L-1時,對酪氨酸酶的活性的抑制率可達50%。與空白對照組比較,各濃度的姜辣素和氫醌均能夠顯著降低黑素含量(P＜0.05或P＜0.01),但不呈劑量依賴性,濃度＞25.0 μmol·L-1時,抑制黑素含量的水平基本無變化。結論姜辣素能有效抑制黑素細胞增殖和降低酪氨酸酶活性和黑素含量,從而減少黑素合成。

姜辣素;黑素瘤細胞;增殖;酪氨酸酶;黑素合成

皮膚色澤是由許多因素互相作用而造成的。皮膚色素大致分兩大類,一類是自身產生的,稱為內源性色素;另一類是外來的,稱為外源性色素。由于遺傳、代謝、內分泌、營養不良、化學劑藥物、物理等因素可造成不同程度的色素沉著病,如雀斑、神經皮膚黑變病、黃褐斑等,這類疾病的治療也是公認的難題。西藥療法存在不良反應大、易復發等缺陷,而中藥治療有其獨特的優勢。筆者所在課題組在研究治療色素異常等疾病的藥物中,發現姜辣素有一定的減少皮膚色素、使膚色變白的作用。本研究利用小鼠B16黑色素瘤細胞作為實驗研究的受試細胞,分別考察姜辣素對細胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 姜辣素(主要含6-姜酚,由寶雞宏遠生物制藥提供,批號:200911024,配制方法:以二甲亞砜溶解,超聲助溶,配制成200 μmol·L-1儲備液,-20℃保存備用)。氫醌(Hydroqiunone,浙江日升昌藥業有限公司,批號:20111221);達爾伯克改良伊格爾培養液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM,美國Gibco公司,批號:2/2012);胎牛血清(美國Hyclone公司,批號:9/2012),錐蟲藍、胰酶、TrotonX-100 (scientific research special,批號:06/2012),四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT,America Amresco公司,批號:10/2012]。

1.2 儀器 二氧化碳培養箱(日本三洋公司,MCO-18AIC型),倒置顯微鏡(中國江南光電,XD-101型),微量振蕩器(江蘇沈高康健生化器具廠,MM-3型),酶標儀(美國伯樂公司,BIO-RAD550型),凈化工作臺(中國上海,YJ-875型),立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠,LDZX-75KBS型)。

1.3 細胞株 B16鼠黑素瘤細胞,購自上海中科院細胞庫。

1.4 實驗分組 無菌操作,用DMEM培養液分別將姜辣素和陽性對照藥物氫醌配制成不同濃度的稀釋液:12.5,25.0,50.0,100.0,200.0 μmol·L-1。內徑0.45 μm微孔濾膜過濾后,低溫、避光儲存。DMEM作為空白對照,每組分別設置4個復孔。

1.5 細胞的培養 將細胞置于37℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱培養,細胞長滿至培養瓶底80%時,傾去舊培養液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗滌2次,加入0.25%胰酶0.5 mL,輕輕晃動使胰酶浸潤培養瓶內細胞,倒掉多余胰酶,將培養瓶放置于培養箱中,3 min后取出。在倒置顯微鏡下觀察細胞,當細胞突起收回變圓時,立即加入適量新鮮的完全培養液,吹打為單細胞懸液,后將細胞懸液分裝至新的細胞培養瓶,繼續培養,一般每3～4 d傳代一次,每次實驗取同一代的細胞進行實驗。

1.6 細胞增殖率測定 實驗中選擇處于對數生長期的小鼠B16黑素瘤細胞,用0.25%胰酶將其消化、吹散,收集并用培養液稀釋細胞濃度為2×104個·mL-1,每孔100 μL,接種于96孔培養板,繼續培養。觀察待細胞貼壁后吸去培養液,分別加入含姜辣素和氫醌的培養液200 μL,同時設置空白對照孔,加入空白培養液,培養48 h后,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,繼續培養4 h后棄去上清液,每孔加入二甲亞砜溶液150 μL,震蕩10 min后,于490 nm波長處測定吸光度值(A值)。增殖率(%)=加藥組A值/空白對照組A值×100%[1]。

1.7 細胞內酪氨酸酶活性測定 將加入含藥培養液的細胞繼續培養48 h后棄培養液,用PBS洗滌2次,加入1%曲拉通溶液50 μL,-80℃凍存30 min,室溫下融化,37℃預熱后,每孔加入0.25%左旋多巴溶液10 μL,37℃條件下反應2 h,于490 nm波長處測定A值。激活率(%)=加藥組A值/空白對照組A值× 100%[2]。

1.8 黑素含量測定 將加入含藥培養液的細胞培養48 h后,0.25%胰蛋白酶將其消化、吹散,收集細胞3 000 r·min-1(r=10 cm)離心10 min,用緩沖液漂洗2次后,加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.5 mL,于37℃下反應48 h,充分將細胞裂解,溶解黑素顆粒。于405 nm波長處測定A值。黑素含量(%)=加藥組A值/空白對照組A值×100%[3]。

1.9 統計學方法 采用SPASS13.0版軟件進行數據分析,測定結果以均數±標準差(±s)表示,組間采用t檢驗進行分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜辣素對小鼠B16黑素瘤細胞增殖的影響 與空白對照組比較,含姜辣素的給藥組均能夠明顯抑制小鼠B16細胞增殖(P＜0.05或P＜0.01),且濃度為200.0 μmol·L-1時,抑制率＞48%。結果見表1。

2.2 姜辣素對B16小鼠黑素瘤細胞酪氨酸酶活性的影響 與空白對照組比較,各濃度姜辣素均能夠顯著降低酪氨酸酶活性(P＜0.05或P＜0.01),姜辣素的濃度為200.0 μmol·L-1時,對酪氨酸酶的活性的抑制率可達50%。結果見表1。

2.3 姜辣素對B16小鼠黑素瘤細胞黑素含量的影響 與空白對照組比較,各濃度姜辣素和氫醌均能夠顯著降低黑素含量(P＜0.05或P＜0.01),但不呈劑量依賴性,濃度＞25.0 μmol·L-1時,抑制黑素含量的水平基本無變化。結果見表1。

3 討論

目前,國內外研究工作者一般采用不同的黑素細胞模型進行皮膚病的研究,常用的細胞有正常人黑素細胞、黑素瘤細胞、永生化黑素細胞株等。正常培養條件下,體外培養正常黑素細胞時,細胞生長速度較為緩慢,若傳代次數較多,細胞便會出現衰亡,無法提供滿足實驗所需要的細胞數量,因此大大限制正常黑素細胞在實驗中的研究和臨床上的應用。永生化黑素細胞株和鼠黑素瘤細胞系已被廣泛應用于相關實驗研究中,尤其是黑色瘤細胞株,因其具有產生黑素的功能,而且對實驗條件要求不高,同時繁殖速度快,生長狀態較為穩定;若能滿足其生長所需的條件時,能夠無限制的繁殖,能夠充分滿足實驗所需,成為研究皮膚病的理想細胞。因此,本研究采用小鼠B16黑素瘤細胞株作為體外模型進行藥效實驗[4-5]。

表1 不同濃度的姜辣素和氫醌對B16黑素瘤小鼠細胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響Tab.1 Effects of different concentration of gingerol and hydroquinone on the proliferation,tyrosinase activity and melanin content in mouse B16 melanoma cell line %,±s

表1 不同濃度的姜辣素和氫醌對B16黑素瘤小鼠細胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響Tab.1 Effects of different concentration of gingerol and hydroquinone on the proliferation,tyrosinase activity and melanin content in mouse B16 melanoma cell line %,±s

與空白對照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with the blank control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

黑素含量空白對照組藥物與濃度/ (μmol·L-1)細胞增殖率酪氨酸酶激活率100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00氫醌組12.592.76±2.11*190.51±2.69*191.13±0.32*125.087.61±2.14*288.71±2.12*285.02±2.01*250.079.12±1.96*284.32±1.45*280.75±2.21*2100.067.65±3.13*278.76±2.32*273.95±2.78*2200.059.32±1.56*262.09±1.21*265.07±1.28*2姜辣素組12.594.05±2.62*196.88±1.3993.33±1.76*125.092.90±1.07*293.58±1.82*288.15±2.30*250.084.52±1.31*282.71±2.182*282.25±0.59*2100.067.27±1.11*274.14±1.4580.15±2.98*2200.052.31±2.02*250.13±1.3180.67±2.31*2

姜辣素是姜科植物提取物之一,其主要成分有2-姜酚、4-姜酚、6-姜酚和姜烯酚等,也是姜科植物生物活性的主要成分,筆者在本實驗分別考察給藥后B16小鼠黑素瘤細胞的細胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量,初步從體外研究了姜辣素抑制黑素合成的作用,結果表明姜辣素能夠顯著抑制B16小鼠黑素瘤細胞的增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量,表明姜辣素能夠有效抑制黑色素生成,從而起到美白的作用。同時,氫醌作為陽性對照藥,目前廣泛應用于外用治療皮膚色素沉著,但其較強的氧化性造成皮膚永久褪色,并引起再生性障礙貧血、致癌等一系列體內毒害反應[6],而姜辣素可從許多可食用的植物中提取分離得到,毒副作用小,用于治療皮膚色素沉著性皮膚病有很好的應用前景。

[1] 涂彩霞,張榮鑫,劉亞玲,等.18味中藥乙醇提取物對小鼠B16黑素瘤細胞增殖及黑素生成的影響[J].中國皮膚科雜志,2006,39(7):400-402.

[2] 姚莉,尚靖,徐建國.B16細胞中酪氨酸酶活性測定的方法學研究[J].新疆中醫藥,2007,25(4):16-18.

[3] 劉邦民,張涓,陶春蓉,等.驗方祛斑湯對A375人黑素瘤細胞黑素合成的影響[J].時珍國醫國藥,2009,20(1): 209-210.

[4] 常淑彪,李永偉,許愛娥.中藥對黑素細胞生物學活性影響的研究進展[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志, 2006,5(4):247-249.

[5] 楊紅.人表皮黑素細胞體外培養及過氧化氫對黑素細胞影響的實驗研究[D].濟南:山東大學,2008:12-13.

[6] 崔霞,鄒明強,胡秀麗,等.皮膚美白劑中氫醌潛在毒性研究進展[J].中國公共衛生,2008,24(7):873-874.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.009

Effects of Gingerol on Melanogenesis of B16 Melanoma Cells

SHEN Fang-li1,HUO Shi-xia2
(1.Xinjiang Yinduolan Uighur Medicine Co.,Ltd.,Urmuqi 830049,China;2. Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine,Xinjiang Laboratory of Uighur Medical Prescription,Urmuqi 830049,China)

ObjectiveTo study the effects of the gingerol on the melanogenesis in melanoma B16 cells.MethodsMelanoma cells were cultured with gingerol at 12.5,25.0,50.0,100.0,200.0 μmol·L-1and positive control drug hydroquinone,respectively,using Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)as the blank control group.The cell proliferation was measured by methyl thiazolyltet tetrazolium(MTT)colorimetric assay.The tyrosinase activity and melanin content were measured by colorimetry assay.ResultsGingerol at different concentrations had inhibitory effect on B16 cell proliferation compared with the blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),the inhibition rate being more than 48%at the dosage of 200.0 μmol·L-1.Tyrosinase activity was inhibited significantly compared with blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),the inhibition rate being up to 50%at the dosage of 200 μmol·L-1.Melanin content was also decreased at all levels of gingerol compared with blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),but not in a dose-dependent manner.The inhibition rate of melanin content reached the plateau at gingerol levels greater than 25.0 μmol·L-1.ConclusionGingerol can inhibit the cell proliferation,tyrosinase activity and decrease melanin synthesis in certain range of concentrations.

Gingerol;Melanoma;Proliferation;Tyrosinase;Melanin

R286;R965

A

1004-0781(2014)10-1291-03

2013-08-01

2013-10-29

*新疆維吾爾自治區青年基金項目(2012211B59)

神芳麗(1982-),女,山東淄博人,實習研究員,學士,主要從事藥物分析研究。電話:(0)13369610991,E-mail:121769574@qq.com。

霍仕霞(1983-),女,四川鹽亭人,助理研究員,碩士,主要從事藥物分析及中藥藥動學研究。電話:(0) 13565889322,E-mail:huoshixia1983@163.com。