白芍總苷對非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質浸潤及纖維化的抑制作用*

韓超,鄭琳穎,呂俊華,趙汝霞,周永標,潘衛松

(1.廣州市中醫醫院科教信息科,廣州 510130;2.暨南大學藥學院,廣州 510632;3.廣州市藥品檢驗所,廣州 510160)

白芍總苷對非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質浸潤及纖維化的抑制作用*

韓超1,鄭琳穎1,呂俊華2,趙汝霞2,周永標3,潘衛松3

(1.廣州市中醫醫院科教信息科,廣州 510130;2.暨南大學藥學院,廣州 510632;3.廣州市藥品檢驗所,廣州 510160)

目的 研究白芍總苷(TGP)對果糖-高脂誘導非酒精性脂肪性肝病大鼠(NAFLD)脂質浸潤及纖維化的作用。方法建立果糖-高脂誘導NAFLD大鼠模型,用藥組分別灌胃給予二甲雙胍(200 mg·kg-1)、TGP大劑量、小劑量(給予TGP 200,100 mg·kg-1);正常對照組和模型對照組均灌胃等量純化水(10 mL·kg-1)。4周后,各組大鼠腹主動脈取血,檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性;空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)含量;檢測胰島素(INS)含量,計算胰島素敏感指數(ISI)的變化;檢測游離脂肪酸(FFA),脂肪細胞因子(Apelin-36)、內臟脂肪素(visfatin)、膠原Ⅲ(COLⅢ)及膠原Ⅳ(COLⅣ)的含量;解剖大鼠,取肝臟,測定肝組織中TG含量,光鏡下觀察肝臟組織病理學改變。結果與模型對照組比較,TGP能有效降低NAFLD大鼠的FBG、Fins含量,提高ISI指數;降低血清和肝組織中TG含量,降低血清ALT、AST活性及FAA、Apelin,visfatin,COLⅢ,COLⅣ含量,結果均差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);鏡檢顯示TGP能改善NAFLD大鼠肝臟脂質浸潤及纖維化的病理學改變。結論TGP可能通過改善NAFLD大鼠異常的糖脂代謝及拮抗胰島素抵抗,有效抑制NAFLD大鼠的脂質浸潤及纖維化。

白芍總苷;果糖;肝病,脂肪性,非酒精性;脂質浸潤;肝纖維化

代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)是一組代謝紊亂疾病,其基本特征包括糖代謝異常、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、中心性肥胖、脂代謝紊亂、高血壓等綜合征[1]。大量研究表明,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)與MS的關系密切,甚至認為NAFLD是MS的一個臨床特點或肝臟表現[2]。本課題組既往研究顯示,TGP對IR-脂肪肝有增強胰島素敏感性、降低血脂和保肝的作用[3-4]。大量研究證實,果糖能干擾糖脂代謝,促進IR,形成MS;并刺激肝臟脂肪生成,形成NAFLD[5-7]。白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP)是從中藥白芍中提取的有效成分。近年藥理研究表明,TGP通過拮抗氧化應激反應、調節導致疾病產生和發展的炎癥細胞因子及影響其相關的信號轉導通路、調節相關的細胞凋亡等作用機制,常用于治療心血管、消化、內分泌代謝、皮膚和骨骼系統病變[8]。筆者采用果糖誘導制備NAFLD-MS模型,探討TGP抑制其脂質浸潤及纖維化的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級斯潑累格·多雷(Sprague Dawley, SD)大鼠,體質量150～180 g,6周齡,雌雄各半,購自廣東省醫學實驗動物中心,生產許可證:SCXK(粵) 2008-0002;使用許可證:SYXK(粵)2008-0084;動物飼養于干燥、通風、安靜的環境。

1.2 試藥 白芍總苷膠囊(商品名:帕夫林,寧波立華制藥有限公司生產,批號:H20055058);鹽酸二甲雙胍片(商品名:美迪康,深圳市中聯制藥有限公司生產,批號:H44024853);果糖(批號:AF10070111-100729-855687,archer daniels midland company);天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)和葡萄糖測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號分別為20111117, 20111115,20111206,20111222);三酰甘油(triglycerides,TG)測定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司,批號:20111212);胰島素(INS)放免檢測試劑盒(北京華英生物技術研究所,批號:20111227);脂肪細胞因子(apelin-36),內脂素(visfatin),膠原Ⅲ(collagenⅢ,COLⅢ),膠原Ⅵ(collagenⅥ,COLⅥ)酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)試劑盒(美國Assay公司,批號分別為R10356-09,E30165,E30458,E30178)。

1.3 儀器 FHS-2A可調高速組織勻漿機(金壇市宏華儀器廠);DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司);TGL-16G型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠);TU-1800紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器公司);RM2135型切片機(德國LEICA公司);NIKON EC30型倒置光學顯微鏡及COOLPIX99 NIKON數碼相機(日本NIKON公司);多功能全波長酶標儀(美國BioTelc公司);R-911全自動放免計數儀(中國科技大學實業總公司)。

1.4 動物造模與分組 取健康SD大鼠60只,雌雄各半,適應性飼養1周,按體質量隨機分為正常對照組和造模組。參考文獻[3-4,9]的方法,并對方法加以改良,把文獻中飲用10%蔗糖水改為10%果糖水進行造模。在造模的第6周末,禁食12 h后,在正常對照組和造模組各隨機抽取大鼠2只,取肝臟做病理切片,在光鏡下觀察到正常對照組肝細胞、肝索、肝竇均無明顯的病理變化;造模組肝細胞明顯腫脹,體積較正常明顯增大,大量肝細胞出現顆粒、空泡變性,局部肝細胞出現壞死、核碎裂、溶解,細胞質內充滿大小不等的脂滴,界限不清,肝竇不清,肝索排列絮亂,顯示復制NAFLD模型成功[10-11]。隨后,把造模組按體質量隨機分為模型對照組、陽性對照組(給予二甲雙胍200 mg·kg-1)、白芍總苷大劑量組、小劑量組(給予白芍總苷200,100 mg·kg-1),灌胃給藥,qd,連續28 d;正常對照組和模型對照組均灌胃等容量純化水(10 mL·kg-1)。藥物劑量均根據藥理試驗中動物與人體間的等效劑量換算得出。

1.5 標本采集及指標觀察 用藥第4周末,各組大鼠禁食不禁水12 h,以3%戊巴比妥鈉(20 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后,腹主動脈取血,3 000 r·min-1(r= 15 cm)離心15 min,分離血清,按照試劑盒說明書方法測定ALT、AST活性;檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、TG含量;檢測INS含量,計算胰島素敏感指數(insulin-sensitivity index,ISI)的變化;檢測FAA、apelin和visfatin含量。取新鮮肝左葉用4%甲醛溶液固定,蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色觀察病理組織學變化。

1.6 統計學方法 數據應用SPSS18.0版統計軟件進行統計分析,以均數±標準差(±s)表示,計量資料采用方差分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血糖、胰島素及胰島素敏感指數 與正常對照組比較,模型對照組FBG、INS含量顯著升高(P＜0.01), ISI指數顯著降低(P＜0.01)。與模型對照組比較,各藥物組均能明顯降低病鼠的FBG和INS(P＜0.01),升高ISI指數(P＜0.01)。見表1。

2.2 血清和肝組織TG 與正常對照組比較,模型對照組血清及肝組織的TG均顯著升高(P＜0.01)。與模型對照組比較,各藥物組均能明顯降低病鼠的TG (P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

2.3 血清相關酶、細胞因子及肝指數 與正常對照組比較,模型對照組大鼠血清的ALT,AST水平及FFA、visfatin,COLⅢ,COLⅣ含量均顯著升高(P＜0.01)。與模型對照組比較,各藥物組均能明顯降低病鼠AST過高的活性(P＜0.01);降低FFA、Apelin,visfatin,COLⅢ及COLⅣ的含量(P＜0.05或P＜0.01);除白芍總苷小劑量組外,其他藥物組大鼠的ALT活性(P＜0.01)均顯著降低。見表3。

表1 5組大鼠血糖、胰島素及胰島素敏感指數的測定結果Tab.1 Determination results of FBG,INS and ISI in five groups of rats ±s

表1 5組大鼠血糖、胰島素及胰島素敏感指數的測定結果Tab.1 Determination results of FBG,INS and ISI in five groups of rats ±s

與正常對照組比較,*1P＜0.01;與模型對照組比較,*2P＜0.01Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01

ISI正常對照組10…組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) FBG/ (mmol·L-1) INS/ (U·L-1) 5.89±1.4911.14±2.10-1.70±0.09模型對照組10…11.30±2.19*119.32±2.62*1-2.24±0.05*1陽性對照組102005.10±2.00*212.89±2.86*2-1.76±0.09*2白芍總苷大劑量組102004.84±0.82*213.40±3.49*2-1.86±0.12*2小劑量組101005.12±1.23*215.26±3.03*2-2.01±0.11*2

表2 5組大鼠血清和肝組織TG測定值Tab.2 Determination results of TG in serum and liver tissue in five groups of rats ±s

表2 5組大鼠血清和肝組織TG測定值Tab.2 Determination results of TG in serum and liver tissue in five groups of rats ±s

與正常對照組比較,*1P＜0.01;與模型對照組比較,*2P＜0.01Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01

組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1)血清TG/ (mmol·L-1)肝組織TG/ (mmol·mg-1)正常對照組10…0.61±0.120.88±0.13模型對照組10…0.88±0.09*11.15±0.13*1陽性對照組102000.61±0.32*20.86±0.07*2白芍總苷大劑量組102000.49±0.15*20.78±0.08*2小劑量組101000.58±0.27*20.84±0.04*2

2.4 大鼠肝組織病理學影響 造模分組后,各組均灌胃給予相應藥物干預治療4周,病理鏡檢顯示:正常對照組的肝臟結構完整,肝索排列有序,肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列,結構清楚,肝細胞為單核或雙核,顆粒大小均勻一致,無明顯的病理變化(圖1A)。模型對照組肝細胞明顯腫脹呈圓形,細胞核被擠向一邊,體積較正常明顯增大,大量肝細胞出現顆粒、空泡變性,局部肝細胞出現壞死、核碎裂、溶解,細胞質內充滿大小不等的脂滴,界限不清,肝竇不清,肝索排列紊亂,從中央靜脈向外周方向出現胞質淡染,匯管區有少量炎細胞浸潤(圖1B)。陽性對照組肝竇清楚,肝索排列較整齊,脂滴減少或消失,匯管區有少量的炎性細胞浸潤(圖1C);白芍總苷大劑量組肝細胞結構近似于正常對照組,肝竇清楚,肝索排列較整齊,匯管區有少量炎性細胞浸潤(圖1D);白芍總苷小劑量組肝細胞結構近似于正常對照組,肝竇清楚,肝索排列較整齊,匯管區有較多炎性細胞浸潤(圖1E)。

3 討論

目前,NAFLD的發病機制尚未完全清楚,“二次打擊”是目前廣為接受的關于NAFLD發病機制學說。第一次打擊是指IR,導致大量的FFA和TG在肝臟沉積,形成肝細胞脂肪變。第二次打擊即氧化應激和脂質過氧化反應,造成肝細胞損傷和炎癥反應[12]。另外, NAFLD意味著內臟脂肪的沉積,而內臟脂肪被認為是內分泌器官,能夠分泌多種激素、促炎性細胞因子和抗炎性因子[13-14],如瘦素、脂聯素等,均參與了IR的發生與進展。治療NAFLD的首要目標是改善IR、糾正代謝紊亂,次要目標是減少肝臟脂肪沉積[15]。visfatin是AKBAL等[16]于2005年研究發現的一種新的具有結合并激活胰島素受體、發揮類胰島素樣作用的激素,并通過旁分泌途徑作用于內臟脂肪組織,促進脂肪組織的分化合成及積聚;還可誘導多種炎性因子的表達,導致全身或局部炎癥反應,因此,有研究認為,visfatin很可能是一個重要的前炎性因子。血清visfatin濃度與內臟脂肪的數量有很強的相關性,但與皮下脂肪關系不大。還有研究發現,visfatin在NAFLD患者血清中的濃度升高,而在肝硬化患者則含量下降[17],提示降低visfatin可能可阻斷或抑制NAFLD的病情進展[18]。

Apelin是孤獨G蛋白耦聯受體(APJ)的內源性配體,是由脂肪細胞分泌的一種新的脂肪因子,與IR、肥胖及糖尿病關系密切[19]。Apelin-APJ系統是具有多種生物學效應生理調節肽。Apelin能誘導肥胖大鼠增加肥胖、IR、肝臟氧化應激和炎癥的作用,而改善胰島素敏感性后,能恢復脂肪細胞Apelin對胰島素延遲反應[20-21]。最近研究結果表明[22],Apelin含量與NAFLD患者的體質量指數及IR指數呈正相關。近年來研究發現[23],肝臟間質的星狀細胞亦可表達Apelin,而其受體APJ則由肝實質細胞表達。在肝硬化時,Apelin在肝星狀細胞表達明顯增加,提示Apelin在炎癥反應和纖維化過程中發揮了重要作用[24]。Apelin能促進肝硬化動脈毛細血管增殖,而阻斷APJ干預肝纖維化的進程[25-26]。

表3 5組大鼠血清ALT、AST、FFA、Apelin,visfatin,COLⅢ和COLⅣ測定值Tab.3 Determination results of the serum level of ALT,AST,FFA,Apelin,visfatin,COLⅢand COLⅣin five groups of rats ±s

表3 5組大鼠血清ALT、AST、FFA、Apelin,visfatin,COLⅢ和COLⅣ測定值Tab.3 Determination results of the serum level of ALT,AST,FFA,Apelin,visfatin,COLⅢand COLⅣin five groups of rats ±s

與正常對照組比較,*1P＜0.01;與模型對照組比較,*2P＜0.01,*4P＜0.05;與白芍總苷大劑量組比較,*3P＜0.01Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01,*4P＜0.05;Compared with high-dose TGP group,*3P＜0.01

?

A.正常對照組;B.模型對照組;C.陽性對照組;D.白芍總苷大劑量組;E.白芍總苷小劑量組圖1 5組大鼠第10周末肝臟組織病理學改變(HE,×20)A.normal control group;B.model control group;C.positive control group;D.high-dose TGP group;E.low-dose TGP groupFig.1 Histopathological changes of liver in five groups of rats at the 10thweek(HE,×20)

本課題組前期研究證明,高脂飲食可導致糖脂代謝紊亂、高胰島素血癥、IR、脂肪肝和高血壓[3-4]。果糖代謝不依賴于胰島素,并可致一系列MS疾病,在攝入相同熱量的情況下,攝入果糖更容易導致脂肪沉淀,同時會使NAFLD患者肝臟中的果糖激酶和脂肪酸合成酶表達明顯增加,從而加速果糖的代謝和脂肪酸的合成,促進肝臟脂質沉積,形成惡性循環[24,27]。因此,用果糖代替蔗糖進行造模,并取得成功。造模結果顯示,用果糖-高脂誘導造模組大鼠同樣出現糖脂代謝紊亂、高胰島素血癥、IR、肝功能異常和肝脂肪沉積,以及apelin和visfatin含量增高等病變,與高脂、高蔗糖飲食引起的IR、MS疾病及NAFLD的形成類似[10-11,28],而且模型復制更為明顯和快捷。據此,筆者認為,用果糖代替蔗糖來造模效果可能更好。目前二甲雙胍是公認治療糖尿病的首選藥,臨床上廣泛用于治療NAFLD[29]。二甲雙胍不僅提高胰島素敏感性,通過直接作用于肝臟胰島素信號,還可通過改變腸道滲透率和隨后的內毒素依賴活化的肝枯否細胞,干預果糖誘發NAFLD,從而保護肝臟[30]。二甲雙胍還可改善果糖誘發代謝綜合征大鼠的高血壓病[31]。因此,本組實驗采用二甲雙胍作為NAFLD實驗的陽性對照藥,并證明實驗是成功的。

本研究結果顯示,白芍總苷和二甲雙胍均可降低NAFLD大鼠的FBG、INS含量,提高ISI,改善胰島素敏感性及異常的糖脂代謝;降低病鼠血清中ALT,AST的活性及FFA、COLⅢ、COLⅣ的含量,降低病鼠血清和肝組織中的TG,從而減輕肝細胞脂肪沉積,改善肝功能;下調visfatin和Apelin表達,改善IR、減輕炎癥反應、抑制肝纖維化;從肝臟病理組織學觀察顯示,TGP能減輕肝細胞炎性細胞浸潤,改善脂肪變性,抑制脂質浸潤,有利于肝細胞和肝組織結構、形態恢復正常。由此,筆者推斷,白芍總苷和二甲雙胍抑制果糖-高脂誘導NAFLD大鼠的脂質浸潤及纖維化作用,可能是藥物通過改善脂質代謝、提高胰島素敏感性、下調visfatin和Apelin表達,拮抗IR,抑制慢性低度炎癥反應等作用的綜合結果。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.010

Inhibitory Effects of Total Glucosides of Paeony on Lipid Infiltration and Fibrosis in NAFLD Rats Induced by Fructose and High-fat Diet

HAN Chao1,ZHENG Lin-ying1,LYU Jun-hua2,ZHAO Ru-xia2,ZHOU Yong-biao3,PAN Wei-song3
(1. Department of Information,Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510130,China;2. Pharmacological College of Jinan University,Guangzhou 510632,China;3.Guangzhou Institute of Drugs Inspection,Guangzhou 510160,China)

ObjectiveTo investigate the effect of total glucosides of paeong(TGP)on the liver lipid infiltration and fibrosis in rats with non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)induced by fructose and high-fat diet.MethodsFructose-highfatty induced NAFLD rat model was established.Metformin(MET,200 mg·kg-1)and TGP(200,100 mg·kg-1)was intragastrically given to the rats in the treatment group,TGP high dose and low dose group,respectively.Normal control group and model control group was intragastrically treated with equivalent distilled water(10 mL·kg-1).At the fourth week after the treatment,all the rats were sacrificed and the indices such as serum fasting blood glucose(FBG),INS,insulin sensitivity index (ISI),triglycerides(TG),apelin-36,visfatin,alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),free fatty acid (FFA),collagenⅢ(COLⅢ),collagenⅣ(COLⅣ)were determined.Hepatic content of TG was determined and the pathological changes in the liver tissues were observed under the microscope.ResultsAs compared with the model control group,TGP effectively decreased FBG,INS,TG in serum and liver tissues,activity of ALT and AST in serum and content of FAA,Apelin, Visfatin,COLⅢand COLⅣ,with significant differences(P＜0.05 orP＜0.01).TGP alleviated lipid infiltration and fibrosis in rat liver tissues.ConclusionTGP can inhibit effectively lipid infiltration and fibrosis of NAFLD rats,probably through improving glucolipid metabolism and antogonizing insulin resistance.

Total glucosides of paeong;Fructose;Liver disease,fatty,nonalcoholic;Lipid infiltration;Liver fibrosis

R965

A

1004-0781(2014)10-1294-06

2013-10-24

2013-12-24

*廣州市科技計劃項目(2010Y1-C491);廣州市中醫藥中西醫結合科技項目(2009-A-10)

韓超(1973-),女,海南文昌人,副主任藥師,學士,研究方向:從事中藥學及實驗藥理學研究。電話:020-81226220,E-mail:wendyhan@163.com。