反相高效液相色譜法測定4-羥基-3-甲氧基苯甲酸及間苯三酚對兒茶酚氧位甲基轉移酶的抑制作用

楊瑞玲,劉宏,王琪,季可菲,宋夢姣

(1.廣州軍區武漢總醫院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫藥大學藥學院,武漢 430065)

反相高效液相色譜法測定4-羥基-3-甲氧基苯甲酸及間苯三酚對兒茶酚氧位甲基轉移酶的抑制作用

楊瑞玲1,2,劉宏1,王琪1,季可菲2,宋夢姣1

(1.廣州軍區武漢總醫院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫藥大學藥學院,武漢 430065)

目的 建立反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定4-羥基-3-甲氧基苯甲酸含量和觀察間苯三酚對兒茶酚氧位甲基轉移酶(COMT)的抑制作用。方法利用COMT催化3,4-二羥基苯甲酸生成4-羥基-3-甲氧基苯甲酸的原理,通過提取小鼠肝臟勻漿中的COMT 20 μL,在反應體系中分別加入1×10-3mol·L-1鄰苯二酚及5×10-3,1×10-3,2×10-4mol·L-1間苯三酚各10 μL,利用RP-HPLC法測定產物生成量來分析間苯三酚對COMT的抑制作用。結果間苯三酚在5×10-3,1×10-3,2×10-4mol·L-13個濃度下對COMT活性均有抑制作用,抑制率分別為25.3%,17.6%,8.9%。結論間苯三酚對COMT活性具有抑制作用,但抑制作用弱于同濃度的鄰苯二酚。

間苯三酚;兒茶酚氧位甲基轉移酶;色譜法,高效液相,反相;抑制作用

間苯三酚(phloroglucinol)是親肌性非阿托品類純平滑肌解痙藥,除對消化系統和泌尿系統急性痙攣性疼痛具有明顯效果外,其對婦科痙攣性疼痛,如痛經亦有良好的治療效果[1-2]。關于間苯三酚治療痛經的機制研究,筆者未見文獻報道。雌激素代謝是通過兒茶酚氧位甲基轉移酶(catecholamine-O-methyl transferase,COMT)完成的,COMT活性受到抑制會造成雌激素代謝異常[3]。而雌激素與前列腺素水平呈正相關,體內前列腺素生成量增加時痛經癥狀加劇[4]。筆者設想間苯三酚的解痙作用與COMT的活性受到抑制有關。為了驗證該設想,筆者在本研究利用COMT催化3,4-二羥基苯甲酸(3,4-dihydroxy benzoic acid,DBA)生成4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid,4-OH-3-MBA)的原理[5],利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法,以COMT抑制劑鄰苯二酚為陽性對照[6],通過測定產物生成量來觀察間苯三酚對COMT的抑制作用,以期為間苯三酚治療痛經作用機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雌性昆明小鼠,體質量20～22 g,共40只,購自華中科技大學實驗動物中心,使用許可證號:SYXK(鄂)2010-0057,生產許可證號:SCXK (鄂)2010-0009。實驗前于25℃相對濕度60%清潔通風環境下飼養。

1.2 試藥 3,4-二羥基苯甲酸(上海晶純實業有限公司,批號:40230,純度≥97.0%);4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(ACROS organics公司,批號:A02739066,純度≥98.5%);S-腺苷甲硫氨酸對甲苯磺酸(上海晶純實業有限公司,批號:24777,純度≥80.0%,簡稱:SAM);間苯三酚(J&K chemical公司,批號:LN40M09,純度≥99.0%);鄰苯二酚(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20121016,純度≥98.0%),其余試劑均為國產分析純,實驗用水為純化水。

1.3 儀器 Agilent 1220型高效液相色譜儀(美國Agilent公司,DAD檢測器);TGL-16B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);DW-86L386立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司);WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);SY-2-4恒溫水浴鍋(天津歐諾儀器儀表有限公司);萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.4 肝臟組織樣品的制備 所有小鼠處死后,剖開其腹部,迅速取出肝臟組織置于冰冷0.9%氯化鈉溶液中,用0.9%氯化鈉溶液洗凈后儲存于-80℃冰箱中備用。用濾紙吸干組織表面的水分,稱取1 g,以1∶3(W/V)的比例加入冰冷的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)勻漿。勻漿液以15 000 r·min-1(r=10 cm)離心30 min,取上清液再次離心15 min,上清液部分為含COMT的粗酶液。

1.5 樣品反應體系的制備 取含有0.2 mmol·L-1DBA、0.2 mmol·L-1SAM、2 mmol·L-1氯化鎂的100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.8),加入粗酶液20 μL。隨機分為A、B、C、D、E 5組,每組8只小鼠血漿。A組為空白對照組,B組為鄰苯二酚組,C、D、E組分別為間苯三酚大劑量組、中劑量組、小劑量組。A組為空白,B組加濃度為1×10-3mol·L-1的鄰苯二酚溶液10 μL,C、D、E組分別加濃度各為5×10-3,1×10-3, 2×10-4mol·L-1的間苯三酚溶液10 μL。各組反應體系的總體積均為1 mL,渦旋后在37℃下孵育60 min,加入冰冷的2 mmol·L-1高氯酸溶液160 μL以終止反應,冰浴10 min,15 000 r·min-1(r=10 cm)離心15 min,取上清液待測[7]。

1.6 色譜條件 色譜柱:Welchrom C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.7%醋酸水溶液(25∶75);檢測波長254 nm;流速1.0 mL·min-1;進樣體積20 μL;柱溫30℃。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0版統計軟件進行分析,各組數據以均數±標準差(±s)表示,組間比較進行單因素方差分析,A組分別與其他組進行獨立樣本t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 專屬性 在“1.6”項色譜條件下,空白小鼠肝臟組織樣品、加入4-OH-3-MBA標準品的小鼠肝臟組織樣品及反應體系樣品的色譜圖見圖1所示,4-OH-3-MBA的保留時間為15.8 min,肝臟內源性物質不干擾樣品測定,該方法專屬性強。

2.2 線性關系考察 取4-OH-3-MBA標準品100 mg,精密稱定,置100 mL棕色量瓶中,加適量流動相溶解后,定容搖勻,精密移取10 mL置于100 mL棕色量瓶中,制得質量濃度為100 μg·mL-1的標準品儲備液。分別取儲備液0.5,1.0,5.0,10.0,15.0 mL用流動相稀釋得質量濃度為0.5,1.0,5.0,10.0,15.0 μg·mL-1的標準溶液,精密吸取各標準溶液20 μL,注入液相色譜儀進樣分析,記錄峰面積。以4-OH-3-MBA的質量濃度(ρ)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸,線性方程為:A=927 273.28ρ+84 596.03(r= 0.999 8),表明4-OH-3-MBA在0.5～15.0 μg·mL-1內質量濃度與峰面積呈現良好的線性關系。

A.空白肝臟提取液;B.空白肝臟提取液中加4-OH-3-MBA;C.體系中加間苯三酚反應60 min;1.4-OH-3-MBA;2. DBA;3.未知物(不干擾測定)圖1 肝臟提取液HPLC色譜圖A.blank liver extraction;B.blank liver extraction spiked with 4-OH-3-MBA;C.reaction system spiked with phloroglucinol after 60 min;1.4-OH-3-MBA;2.DBA;3.unknown substance(without interference on analysis)Fig.1 HPLC chromatograms of liver extraction

2.3 檢測限和定量限 取4-OH-3-MBA適量,分別加流動相稀釋至主峰響應值約為基線噪音水平濃度3倍和10倍,作為最低檢測限溶液和定量限溶液。各精密吸取20 μL注入液相色譜儀,進樣測定,記錄峰面積,計算最低檢測限為1.7 ng,定量限為5.6 ng,線性關系在設定范圍內能夠滿足定量要求。

2.4 精密度實驗 取質量濃度為5.0 μg·mL-1的標準溶液,按照“1.6”項色譜條件,連續進樣測定5次,記錄峰面積,日內RSD為0.61%(n=5);取同樣濃度的標準溶液,按“1.6”項色譜條件,連續5 d,每日進樣測定1次,記錄峰面積,日間RSD為0.72%(n=5)。表明該方法的精密度良好。

2.5 重復性實驗 按照“2.2”項下標準品儲備液的制備方法,配制質量濃度為5.0 μg·mL-1的標準溶液共5份,按照“1.6”項色譜條件,分別進樣測定峰面積,重復性RSD為1.13%(n=5),符合測定要求。

2.6 穩定性實驗 取樣品反應體系溶液,于室溫下放置,分別于0,2,4,8,12,24 h取樣適量,照“1.6”項色譜條件測定峰面積,穩定性RSD為1.70%(n=6)。室溫24 h內,樣品溶液穩定性好,符合測定要求。

2.7 加樣回收率實驗 取空白肝臟組織勻漿液,按照“1.5”項制備方法(不加DBA),在0.5,5.0, 15.0 μg·mL-13個添加水平下進行加樣(4-OH-3-MBA)回收率實驗,每個濃度各設6個平行樣。小、中、大3個劑量的加樣回收率分別為95.6%,101.2%, 99.7%,RSD分別為2.71%,3.58%,3.13%,說明該方法準確度良好。

2.8 結果 見圖2。結果表明:與A組比較,C、D、E組均差異有統計學意義(t分別為6.83,4.84,238,P＜0.05)。用抑制率來評價各組藥物對COMT活性的抑制作用強弱。抑制率(%)=(各組產物濃度-空白對照組產物濃度)/空白對照組產物濃度×100%。經計算,B組抑制率為42.9%,C組抑制率為25.3%,D組抑制率為17.6%,E組抑制率為8.9%。

3 討論

前列腺素類物質廣泛存在于人體組織中,與許多生殖系統疾病如痛經等密切相關,痛經患者子宮內膜內前列腺素過高是造成該病發生的重要原因[8]。臨床上常用非甾體抗炎藥治療痛經,該藥通過抑制環氧化酶而減少前列腺素的生物合成來緩解痛經癥狀。在痛經患者子宮內膜異位癥中,前列腺素水平與雌激素呈正相關[4],而COMT為雌激素代謝過程中的關鍵酶之一,肝臟COMT活性水平與肝臟雌激素代謝能力密切相關[9-10]。COMT催化2-或4-羥基雌激素的甲基化,生成2-或4-甲氧基雌激素,羥基雌激素、甲氧基雌激素已被證明有抑制或增強雌激素的作用,在鼠孕期COMT抑制劑能夠調節子宮肌層的收縮與舒張[11]。

與A組比較,*1P＜0.01圖2 間苯三酚與鄰苯二酚對小鼠肝臟COMT活性的影響Compared with group A,*1P＜0.01Fig.2 Effect of phloroglucinol and catechol on COMT activity in the liver of mice

本研究通過與COMT陽性抑制劑鄰苯二酚的對比研究,發現不同濃度的間苯三酚對COMT活性均有抑制作用,且劑量越大抑制作用越強,呈明顯的量效依賴關系。說明間苯三酚的解痙機制可能與其抑制COMT的活性,從而影響雌激素代謝有關。本研究為進一步闡明間苯三酚解痙鎮痛作用機制提供一種思路,同時也為治療痛經的藥物開發提供新途徑。

本研究僅從間苯三酚體外抑制COMT活性的角度來說明其發揮解痙作用的可能途徑,但間苯三酚也有可能通過某些離子通道的信號傳導或通過其在體內的代謝物發揮藥效,尚待進一步研究。

[1] 夏瓊.間苯三酚治療原發性痛經的臨床觀察[J].中國醫院藥學雜志,2007,27(10):1426-1427.

[2] 劉洪梅,謝翠英.間苯三酚治療原發性痛經療效觀察[J].吉林醫學,2011,32(32):6768-6769.

[3] XIE T,HO S L,RAMSDEN D.Characterization and implications of estrogenic down-regulation of human catechol-O-methyl transferase gene transcription[J].Mol Pharmacol, 1999,56(1):31-38.

[4] BULUN S E,FANG Z,IMIR G,et al.Aromatase and endometriosis[J].Semin Reprod Med,2004,22(1):45-50.

[5] BONIFACIO M J,PALMA P N,ALMEIDA L,et al. Catechol-O-methyltransferaseanditsinhibitorsin Parkinson's disease[J].CNS Drug Rev,2007,13(3): 352-379.

[6] BARROW C J.Inhibitors of catechol-O-methyl transferase [J].CNS Neurol Disorder Drug Targets,2012,11(3):324-332.

[7] 林翠鴻,王長連,黃品芳,等.高效液相色譜-電化學法測定人紅細胞兒茶酚氧位甲基轉移酶活性[J].中國醫院藥學雜志,2008,28(13):1082-1085.

[8] 遲曉麗,劉國云,周文霞,等.原發性痛經的治療藥物和治療靶點研究進展[J].軍事醫學科學院院刊,2007,31 (5):471-473.

[9] SAVANDE M,ROPPONENA,AVELA K,et al.Genetic evidence of heterogeneity in intrahepatic cholestasis of pregnancy[J].Gut,2003,52(7):1025-1029.

[10] GERSTNER S,GLASEMANN D,PFEIFFER E,et al.The influence of metabolism on the genotoxicity of catechol estrogens in three cultured cell lines[J].Mol Nutr Food Res,2008,52(7):823-829.

[11] WENTZ M J,SHAO Q S,LEILI S,et al.Treatment with an inhibitor of catechol-O-methyl transferase activity reduces preterm birth and impedes cervical resistance to stretch in pregnant rats[J].Reproduction,2007,134(6):831-839.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.012

Determination of 4-Hydroxy-3-Methoxy Benzoic Acid by RP-HPLC and Inhibitory Effect of Phloroglucinol on Catecholamine-O-Methyl Transferase

YANG Rui-ling1,2,LIU Hong1,WANG Qi1,JI Ke-fei2,SONG Meng-jiao1
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military,Wuhan 430070,China;2.College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo detect content of 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid by RP-HPLC and observe the inhibitory effect of phloroglucinol on catecholamine-O-methyl transferase(COMT).MethodsThis study used the principle of 3,4-dihydroxy benzoic acid transforming to 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid under COMT’s catalytic action.COMT(20 μL)was extracted from mouse liver homogenate.In a reaction system,10 μL catecol(1×10-3mol·L-1)and 10 μL phloroglucinol(5×10-3, 1×10-3and 2×10-4mol·L-1,respectively)were added.Products were determined by RP-HPLC to analyze effects of 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid on COMT.ResultsPhloroglucinol had inhibitory effect on COMT activity at concentrations of 5×10-3mol·L-1,1×10-3mol·L-1and 2×10-4mol·L-1,with the inhibition rate being 25.3%,17.6%and 8.9%,respectively.ConclusionPhloroglucinol has an inhibitory effect on COMT activity,which is weaker than the effect of catechol of the same concentration.

Phloroglucinol;Catecholamine-O-methyl transferase;HPLC;Inhibitory effect

R984;R927.2

A

1004-0781(2014)10-1303-04

2013-09-27

2014-02-08

楊瑞玲(1988-),女,湖北鐘祥人,碩士,研究方向:藥物制劑新技術與新劑型。電話:(0)13797077421,E-mail:ling19880611@126.com。

劉宏(1968-),男,湖北枝江人,主任藥師,博士,研究方向:藥物制劑新技術與新劑型。電話:027-68878601,E-mail:honguil@163.com。