十字孢堿對人膽管癌QBC-939細胞增殖和凋亡的影響

何政,鄭軍

(湖北省宜昌市中心人民醫院普通外科一病區,宜昌 443002)

十字孢堿對人膽管癌QBC-939細胞增殖和凋亡的影響

何政,鄭軍

(湖北省宜昌市中心人民醫院普通外科一病區,宜昌 443002)

目的 探討蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制藥十字孢堿(STS)對人膽管癌QBC-939細胞增殖和凋亡的影響及其機制。方法采用CCK-8法檢測STS對QBC-939細胞增殖的影響;透射電子顯微鏡觀察STS對QBC-939細胞超微結構的影響;流式細胞術檢測STS對QBC-939細胞凋亡率和周期分布的影響;蛋白質印跡法檢測STS對QBC-939細胞周期蛋白cyclin B1、細胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk1)和磷酸化周期蛋白依賴性激酶(p-Cdk1)表達的影響。結果STS能顯著抑制QBC-939細胞的增殖(P＜0.05),抑制作用呈濃度依賴性,對QBC-939細胞的半數抑制濃度(IC50) 24 h為334 nmol·L-1,48 h為118 nmol·L-1。透射電鏡觀察發現,STS能誘導QBC-939細胞出現典型的凋亡小體。Annexin V-FITC/PI雙標法檢測0,12,24和48 h凋亡率分別為(10.16±4.52)%,(22.35±2.19)%,(34.27±2.30)%和(59.70±5.97)%。流式細胞術檢測發現,與對照組相比,STS可顯著誘導QBC-939細胞凋亡率增加(P＜0.05),并引起G0/G1期細胞比例減少,而G2/M期細胞比例增加(P＜0.05)。蛋白質印跡法檢測發現,經STS處理后的QBC-939細胞cyclin B1和Cdk1蛋白表達明顯降低(P＜0.05),而p-Cdk1蛋白表達則明顯增加(P＜0.05)。結論STS可顯著抑制人膽管癌QBC-939細胞增殖并誘導其凋亡,其機制可能是通過阻滯細胞周期于G2/M期,進而抑制QBC-939細胞生長并促進細胞凋亡。

十字孢堿;蛋白激酶C抑制藥;膽管癌;細胞周期;凋亡;QBC-939細胞

膽管癌是膽道系統常見的惡性腫瘤,近年來其發病率有明顯增高的趨勢[1]。由于膽管癌特殊的解剖部位以及缺乏早期有效的診斷標志物,大多數膽管癌在最終明確診斷時已屬中晚期,失去根治性切除的機會,因此患者預后極差[2]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一種鈣激活和磷脂酶依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,PKC通過磷酸化一系列底物進而參與細胞內廣泛的生物學效應,其對細胞的增殖、分化、凋亡和運動等過程均有一定調節作用[3]。同時,越來越多的研究表明,PKC在人類多種腫瘤中存在異常激活,是腫瘤細胞維持其惡性生物學表型的重要信號分子[4]。十字孢堿(staurosporine,STS)是從微生物中分離出的一種生物堿,是已知化合物中最強PKC抑制藥。研究發現,STS具有潛在的抗腫瘤活性,能抑制多種人類腫瘤的生長并促進其凋亡。但STS對膽管癌細胞的影響筆者未見文獻報道。筆者在本研究以人膽管癌QBC-939細胞為研究對象,觀察STS對膽管癌細胞增殖、凋亡等的影響,并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑 人膽管癌細胞系QBC-939購自中國科學院上海細胞庫;RPMI 1640培養液和胎牛血清購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒(CK04)購自日本Dojindo公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI,批號:P4170)、RNA酶(RNase A,批號:R4642)和PKC抑制藥STS (批號:S5921)購自美國Sigma公司,STS用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成濃度為1 mmol·L-1的原液并儲存于-20℃,實驗時根據需要用RPMI 1640培養液將原液稀釋成不同濃度的工作液;Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒(批號:V13241)購自美國Invitrogen公司;RIPA裂解液(批號:P0013B)、2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒(批號:P0010)購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗人cyclin B1、周期蛋白依賴性激酶(Cdk1)和p-Cdk1(pY15)單克隆抗體購自美國Epitomics公司;鼠抗人β-actin單克隆抗體及辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 儀器 酶標儀型號ELX800(美國Biotek公司);透射電鏡型號Tecnai G2 F20 S-TWIN(美國FEI公司);流式細胞儀型號為FACScan(美國BD公司)。

1.3 細胞培養 細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液,常規在37℃、5%二氧化碳的細胞培養箱中培養,0.25%胰酶消化、傳代,取對數生長期細胞進行實驗。

1.4 細胞增殖活性的測定 采用CCK-8法檢測,將對數生長期QBC-939細胞以2.0×105個·mL-1密度接種于96孔培養板中,每孔200 μL置于培養箱中培養,待細胞完全貼壁后吸去培養液,分別加入含10,25, 50,100,250和500 nmol·L-1STS的培養液200 μL,并設立不加任何處理的對照組,繼續培養24和48 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μL作用4 h,于酶標儀波長450 nm處測定吸光度(A)值。計算細胞的存活率和抑制率。細胞存活率(%)=藥物處理組平均A值/細胞對照孔平均A值×100%;細胞抑制率(%)=(1-藥物處理組平均A值/細胞對照孔平均A值)×100%。同時根據抑制率計算出細胞的半數抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)。

1.5 電鏡下觀察細胞超微結構的變化 將處于對數生長期的QBC-939細胞傳代于50 mL培養瓶中常規培養,待細胞長至約80%融合度時吸去培養液,分別加入濃度為250 nmol·L-1STS和不含STS的完全培養液,繼續培養24 h;消化收集細胞后,立即置于2.5%戊二醛溶液中預固定,0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)清洗3次,過夜;其后以1%鵝酸溶液固定,丙酮逐級脫水,環氧樹脂包埋,超薄切片,經鈾和鉛雙重染色后,于透射電子顯微鏡下觀察細胞超微結構的變化。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡 將處于對數生長期的QBC-939細胞以每孔2×105個接種于6孔板,待細胞完全貼壁后吸去培養液,用濃度為250 nmol·L-1的STS培養液分別處理細胞0,12,24和48 h,隨后按照凋亡試劑盒說明書進行操作,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期 將處于對數生長期的QBC-939細胞以每孔2×105個細胞密度接種于6孔板,待細胞完全貼壁后吸去培養液,用濃度為250 nmol·L-1的STS培養液分別處理細胞0,12,24和48 h,隨后消化、收集細胞,用4℃預冷的PBS洗2次,并重懸細胞于PBS 200 μL,緩慢加入預冷的無水乙醇1 mL,于-20℃固定過夜;之后離心收集細胞,4℃預冷的PBS洗2次,并重懸于PBS 500 μL中,分別加入終濃度為50 μg·mL-1的RNA酶(RNase A)及PI,室溫避光反應30 min后上流式儀檢測細胞周期分布。采用CellQuest和ModFit軟件分析實驗結果。

1.8 蛋白質印跡 將處于對數生長期QBC-939細胞接種于6 cm的培養皿中,待細胞完全貼壁后吸去培養液,用濃度為250 nmol·L-1STS培養液分別處理細胞0,12和24 h;消化收集細胞,加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,冰上孵育20 min后于4℃,12 000×g離心15 min。上清液即為細胞總蛋白。按照BCA法蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度,以50 μg蛋白上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠電泳,電泳結束后將膠上蛋白電轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;分別加入一抗(稀釋比例均為1∶500)于雜交袋中4℃孵育過夜;次日用三羥甲基氨基甲烷聚山梨酯(TBS-T)洗滌緩沖液洗膜3次,每次15 min,二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h; TBS-T洗膜3次,每次10 min;采用電致化學發光(electrochemiluminescence,ECL)法進行顯色、曝光。用圖像分析軟件Image J進行灰度分析;以目的蛋白與內參照蛋白的相對表達量進行半定量分析。

1.9 統計學方法 上述實驗均重復3次,采用SPSS 15.0版軟件作統計處理,計量數據以均數±標準差(±s)表示。不同處理組間差異采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 STS對QBC-939細胞增殖活性的影響 CCK-8檢測結果表明,STS對QBC-939細胞的生長有顯著抑制作用,且這種抑制作用呈明顯的濃度和時間依賴性(圖1)(F=37.85,P＜0.01)。STS對QBC-939細胞的IC5024 h為334 nmol·L-1,48 h為118 nmol·L-1。

圖1 CCK-8法檢測STS對QBC-939細胞增殖活性的抑制作用Fig.1 Inhibitoryeffectofstaurosporineoncell proliferation of QBC-939 cells detected by CCK-8 assay

2.2 STS對QBC-939細胞形態學的影響 透射電鏡下觀察可見,未用STS處理的QBC-939細胞形體較大,胞質均勻且含有豐富的線粒體、內質網等細胞器,核質均勻,無明顯染色質邊集;而在250 nmol·L-1STS作用24 h后,可見QBC-939細胞體積縮小,其內可見線粒體、內質網等細胞器腫脹明顯,數量減少,同時細胞核內染色質高度濃縮并邊集于核膜下呈新月形,有的出現核固縮和核碎裂等凋亡變化,脫落后形成凋亡小體。見圖2。

2.3 STS對QBC-939細胞凋亡率的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡率。結果顯示:250 nmol·L-1STS分別作用QBC-939細胞0,12, 24和48 h后,其凋亡率分別為(10.16±4.52)%, (22.35±2.19)%,(34.27±2.30)%和(59.70± 5.97)%。表明隨著藥物作用時間的延長,細胞凋亡率亦逐漸上升,實驗組與對照組比較,差異有統計學意義(F=81.08,P＜0.01)。見圖3。

A.QBC-939細胞;B.250 nmol·L-1STS作用的QBC-939細胞圖2 透射電子顯微鏡下觀察STS對QBC-939細胞超微結構的影響(×1 700)A.QBC-939 control cells;B.250 nmol·L-1STS treated QBC-939 cellsFig.2 Effect of staurosporine on ultrastructure of QBC-939cellsdetectedbytransmissionelectronmicroscopy (×1 700)

A.0 h;B.12 h;C.24 h;D.48 h圖3 流式細胞術檢測STS對QBC-939細胞凋亡率的影響A.0 h;B.12 h;C.24 h;D.48 hFig.3 Effect of staurosporine on apoptotic rate of QBC-939 cells detected by flow cytometry

2.4 STS對QBC-939細胞周期的影響 250 nmol·L-1的STS作用QBC-939細胞0,12,24和48 h后流式細胞術檢測細胞周期,結果顯示:藥物作用12和24 h后, QBC-939細胞的S期比例依次下降(F=698.0,P＜0.01),同時G2/M期比例依次增加(F=136.8,P＜0.01),而G0/G1比例無明顯變化;當STS作用48 h后引起了QBC-939細胞顯著的凋亡,周期分布與空白對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 流式細胞術檢測STS作用不同時間對QBC-939細胞周期的影響Tab.1 Effect of STS on cell cycle of QBC-939 cells detected by flow cytometry %,±s

表1 流式細胞術檢測STS作用不同時間對QBC-939細胞周期的影響Tab.1 Effect of STS on cell cycle of QBC-939 cells detected by flow cytometry %,±s

與0 h比較,*1P＜0.01Compared with 0 h,*1P＜0.01

時間/hG0/G1SG2/M 凋亡率066.79±4.0623.09±1.0810.12±2.983.73±0.63 1266.03±1.1812.24±0.23*121.74±0.95*115.59±1.84 2460.97±2.628.27±0.56*130.78±2.07*122.74±2.77 4871.22±0.4720.03±0.818.76±0.3355.88±5.06

2.5 STS對QBC-939細胞周期蛋白的影響 蛋白質印跡法檢測結果顯示,250 nmol·L-1的STS作用12和24 h后,與對照組比較,cyclin B1和Cdk1蛋白表達水平逐漸降低(P＜0.05),而p-Cdk1蛋白表達水平則逐漸增加(P＜0.05)。見圖4。

3 討論

膽管癌的發生和發展受多種因素影響,其中細胞周期的調節異常在膽管腫瘤的惡性增殖過程中起重要作用[5-6]。PKC廣泛分布于真核細胞中,具有多個亞型,在細胞的信號轉導過程中發揮著重要作用,并參與人體內多種的生理和病理過程[7]。然而隨著研究的不斷深入,PKC在腫瘤中的異常調節作用逐漸被人們所重視,其同樣參與并維持了膽管癌的惡性生物學特性[8-9]。而一般認為腫瘤的惡性增殖與其細胞周期之間密切相關,研究表明PKC參與腫瘤細胞的周期調節過程,并對細胞的G1期和G2/M期時相轉換具有重要調節作用[10]。

STS是一種廣譜的PKC抑制藥,主要作用于PKC的催化區,通過與ATP競爭結合PKC的ATP結合位點而發揮抑制作用。研究表明,STS能夠抑制如宮頸癌[11]、前列腺癌[12]、口腔癌[13]等多種腫瘤細胞生長及促進其凋亡,然而目前關于STS對膽管癌細胞的作用尚不明確。本研究通過體外細胞增殖活性檢測、電鏡下超微結構觀察、流式細胞術等方法,發現STS在體外能顯著抑制人膽管癌QBC-939細胞生長,并且這種抑制作用具有濃度和時間依賴性;同時,STS能誘導QBC-939細胞發生凋亡,且細胞凋亡率隨著藥物作用時間的延長而逐漸增加。

與0 h比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01圖4 蛋白質印跡法檢測STS對QBC-939細胞周期蛋白的影響Compared with 0 h,*1P＜0.05,*2P＜0.01Fig.4 Effect of staurosporine on the expressions of cell cycle-related proteins in QBC-939 cells detected by western blotting

大量研究表明,細胞周期阻滯與細胞凋亡之間關系密切。而在細胞周期的調控過程中存在兩個限制點,即G1/S期限制點和G2/M期限制點。當外界各種刺激因素作用細胞時,其通過激活限制點引起G1/S期或G2/M期阻滯,使細胞有時間完成損傷修復,以保證細胞的存活;而當損傷超過細胞修復能力時,則會促使細胞凋亡[14]。有文獻報道STS能夠誘導人口腔上皮癌KB細胞和結腸癌HT-29細胞周期阻滯于G2/M期,從而達到抑制細胞增殖的作用[13,15]。本研究結果也證實,STS抑制人膽管癌QBC-939細胞增殖的同時,可誘導細胞周期阻滯于G2/M期。STS作用12 h后,QBC-939細胞的G2/M期比例即顯著升高;作用24 h后G2/M期比例進一步升高;到48 h后,G2/M期比例下降,而細胞的調亡率卻明顯增加,提示STS可能是先誘導細胞周期阻滯,而后引起細胞凋亡。

在細胞周期過程中,周期蛋白cyclin B1和Cdk1是G2/M期的關鍵調節蛋白,二者可形成cyclin B1/ Cdk1復合物,該復合物的活化是G2期進入M期的必要條件;而Cdk1被磷酸化后其活性受到抑制,進而引起G2/M期阻滯[16]。通過蛋白質印跡法檢測發現,250 nmol·L-1STS分別作用QBC-939細胞12和24 h后,細胞內cyclin B1和Cdk1蛋白表達水平逐漸降低,而p-Cdk1蛋白表達水平則逐漸增加,提示細胞被阻滯于G2/M期,這與細胞周期分布的結果相一致。

綜上所述,本研究從體外實驗證明STS可引起人膽管癌QBC-939細胞周期阻滯于G2/M期并誘導其凋亡。而STS誘導QBC-939細胞G2/M期阻滯的分子基礎可能與其降低cyclin B1、Cdk1表達水平,同時上調p-Cdk1表達水平有關,但其具體調控機制尚待于進一步研究。目前,PKC已成為抗腫瘤藥物研究中的重要靶點,其抑制劑STS有望成為抗膽管癌治療的有效藥物之一。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.015

Effects of Staurosporine on the Proliferation and Apoptosis of Human Cholangiocarcinoma QBC-939 Cells

HE Zheng,ZHENG Jun
(Department of Hepatopancreatobiliary Spleen Surgery,the First Clinical Medical College of Three Gorges University,Yichang 443002,China)

ObjectiveTo study the effects of protein kinase C(PKC)inhibitor staurosporine(STS)on the proliferation and apoptosis of human cholangiocarcinoma QBC-939 cells and to explore its possible mechanism.MethodsCCK-8 was used to detect the effects of PKC inhibitor STS on the proliferation of human cholangiocarcinoma QBC-939 cells.The effects of STS on the ultrastructural characteristics of QBC-939 cells were observed by routine transmission electron microscopy(TEM).The apoptosis rate and the cell cycle distribution of QBC-939 cells were detected by flow cytometry.The expression of cyclin B1,Cdk1 and p-Cdk1 in QBC-939 cells was detected by Western blotting.ResultsSTS could significantly inhibit the proliferation of QBC-939 cells in a dose-dependent manner(P＜0.05)and the half inhibitory concentration(IC50)of QBC-939 cells at 24th and 48th h was 334 nmol·L-1and 118 nmol·L-1,respectively.TEM observed that STS could induce typical apoptotic bodies and supermicrostructural changes of QBC-939 cells.By Annexin V-FITC/PI double labeling flow cytometry,we found that the apoptotic rate of QBC-939 cells after treatment with STS for 0,12,24 and 48 h was(10.16±4.52)%,(22.35±2.19)%,(34.27±2.30)%and (59.70±5.97)%,respectively.By flow cytometry,compared with the control group,STS could significantly increase apoptosis rate of QBC-939 cells,decrease the percentage of cells in G0/G1phase and increase the percentage of cells in G2/M phase(P＜0.05). Western blotting proved that the expression levels of cyclin B1 and Cdk1 proteins in the STS-treated QBC-939 cells were significantly decreased(P＜0.05),while the expression level of p-Cdk1 protein in the STS-treated QBC-939 cells was significantly increased(P＜0.05).ConclusionSTS can significantly inhibit cell proliferation and induce apoptosis of human cholangiocarcinoma QBC-939 cells and the mechanism may be related to cell cycle arrest at G2/M phase.

Stanrosporine;Protein kinase C inhibitor;Cholangiocarcinoma;Cell cycle;Apoptosis;QBC-939 cell

R979.1;R965

A

1004-0781(2014)10-1314-05

2013-09-25

2013-11-22

何政(1978-),男,湖北鄂州人,主治醫師,博士,從事膽道胰腺腫瘤方面研究。電話:(0)15872654116,E-mail:805226494@qq.com。

鄭軍(1965-),男,湖北宜昌人,主任醫師,碩士,從事肝膽胰腫瘤方面研究。電話:(0)15871598533,E-mail:zhengjun1995@163.com。