西他沙星溶解度與表觀油水分配系數(shù)研究*

丁維明,李桂玲,蔡聰,王菊仙,楊信怡

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所,北京 100050)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

西他沙星溶解度與表觀油水分配系數(shù)研究*

丁維明,李桂玲,蔡聰,王菊仙,楊信怡

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所,北京 100050)

目的 測定西他沙星在不同溶劑中的溶解度以及表觀油水分配系數(shù),為劑型研究和制備工藝提供依據(jù)。方法采用高效液相色譜(HPLC)法,Dikma Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.4)∶乙腈=70∶30;柱溫:室溫;流速1.0 mL·min-1;檢測波長:295 nm;進樣量10 μL。考察西他沙星在pH為2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2磷酸鹽緩沖液中溶解度和表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果在(37±2)℃條件下,西他沙星在水中的平衡溶解度為0.44 mg·mL-1,表觀油水分配系數(shù)(P)為0.23(lgP= -0.64);在不同pH磷酸鹽緩沖液中,西他沙星在pH 7.4的中性條件下溶解度最低,僅為0.13 mg·mL-1,表觀油水分配系數(shù)最大,在pH＞10及pH＜5.8,西他沙星平衡溶解度顯著增大,表觀油水分配系數(shù)相應(yīng)減小。結(jié)論西他沙星難溶于水,脂溶性也較差,但在酸性和堿性條件下有較高的溶解度。

西他沙星;溶解度;表觀油水分配系數(shù);色譜法,高效液相

西他沙星(sitafloxacin)為第4代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥[1],對革蘭陽性、革蘭陰性和厭氧菌都具有抗菌活性,特別是對氟喹諾酮類耐藥菌株、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、青霉素不敏感肺炎鏈球菌、腸球菌也具有抗菌作用,抗厭氧菌作用與亞胺培南、甲硝唑相當(dāng)。其口服片劑和細顆粒劑已于2008年在日本上市,用于治療敏感菌引起的各類感染以及嚴重難治性感染性疾病[2-5]。國內(nèi)目前尚未有產(chǎn)品上市銷售。筆者建立適用于西他沙星理化性質(zhì)研究的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法,并對方法進行驗證。在此基礎(chǔ)上,對西他沙星在水中及不同pH磷酸鹽緩沖液中的溶解度和油水分配系數(shù)進行了測定,為西他沙星新型制劑的處方設(shè)計、工藝研究和穩(wěn)定性考察提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LC-20AD單元泵,CTO-20AC柱溫箱,SIL-20AC自動進樣器,SPD-M2A檢測器,DGU-20A排氣單元,LC Solution工作站,日本島津);UV-2450紫外分光光度計(日本島津);AE200天平[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司];PHS-3D pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 西他沙星(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所自制,晶型為含有3/2結(jié)晶水的結(jié)晶性粉末,批號:20121023);磷酸二氫鉀(分析純,北京化工廠,批號:20120105);乙腈(色譜純,迪馬公司,批號: 122070);磷酸(分析純,北京化工廠,批號: 20071112)。

2 方法與結(jié)果

2.1 西他沙星的HPLC方法學(xué)

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Dikma Diamonsil C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.4)∶乙腈=70∶30;柱溫室溫;流速1.0 mL·min-1;檢測波長295 nm;進樣量10 μL。

2.1.2 檢測波長的選擇 稱取西他沙星適量,用流動相溶解并稀釋制成濃度約為1 mg·mL-1的溶液,于波長190～400 nm進行紫外掃描,結(jié)果顯示西他沙星溶液在295 nm有最大吸收,故選擇295 nm作為檢測波長。

2.1.3 專屬性實驗 稱取西他沙星適量,用流動相溶解并稀釋制成濃度約為0.1 mg·mL-1的溶液。按上述色譜條件進樣,記錄色譜圖;另分別取空白溶劑(流動相)和正辛醇飽和水,按上述條件進樣,記錄色譜圖。結(jié)果見圖1,可見西他沙星主峰的峰形良好,柱效較高,且溶劑對西他沙星的測定無干擾,專屬性良好。

2.1.4 重復(fù)性實驗 稱取西他沙星適量,用流動相溶解并稀釋制成濃度約為0.1 mg·mL-1溶液,精密量取10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取西他沙星主峰面積,連續(xù)進樣6次,考察其重復(fù)性。結(jié)果RSD為0.12%,表明方法的偏差較小,重復(fù)性較好。

2.1.5 線性關(guān)系考察 取西他沙星適量,精密稱定,用流動相溶解并稀釋制成1 mg·mL-1溶液,作為貯備液;分別精密量取貯備液適量,用流動相稀釋制成500,200,100,50,10 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取西他沙星主峰面積,以主峰面積(A)對濃度(C,μg·mL-1)進行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A= 49 147C-1 383.3(r=1.000,n=3)。結(jié)果表明,西他沙星在10～500 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)主峰面積與濃度之間線性關(guān)系良好。

2.1.6 回收率實驗 精密稱取西他沙星80,100, 120 mg,分別置于100 mL量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為低(80%)、中(100%)、高(120%)濃度的供試品溶液。分別吸取各供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取主峰面積,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算供試品溶液中西他沙星含量,計算回收率。低、中、高3種濃度回收率分別為99.7%, 100.3%,97.0%,RSD為1.4%。

2.1.7 溶液穩(wěn)定性 稱取西他沙星適量,用流動相溶解并稀釋制成濃度約為0.1 mg·mL-1的溶液,于室溫下放置,分別于0,2,4,6,8 h吸取10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取主峰面積,計算RSD。結(jié)果:供試品溶液于不同時間進樣的主峰面積RSD為0.2%,表明西他沙星溶液在室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 檢出限與定量限 配制一定濃度的西他沙星溶液,逐級稀釋,分別進樣10 μL,記錄色譜圖,計算信噪比(S/N)(主峰峰高與基線噪聲的比值),以S/N≥3為檢出限,S/N≥10為定量限。結(jié)果西他沙星的定量限為5.0 ng,檢出限為1.5 ng。

2.2 近似溶解度 稱取研成細粉的西他沙星供試品,分別置于(25±2)℃一定容量的溶劑中,每隔5 min強力振搖30 s;觀察30 min內(nèi)的溶解情況,如看不見溶質(zhì)顆粒時,即判斷為完全溶解。西他沙星在各種溶劑中的近似溶解度結(jié)果見表1。

A.空白溶劑;B.正辛醇飽和水;C.西他沙星溶液;1.西他沙星圖1 西他沙星專屬性實驗HPLC圖譜A.blank solution;B.n-octanol-saturated water;C.sitafloxacin solution;1.sitafloxacinFig.1 HPLC of specificity test on sitafloxacin

表1 西他沙星在不同溶劑中的近似溶解度Tab.1 Approximate solubility of sitafloxacin in different solvents

2.3 平衡溶解度

2.3.1 水中溶解度 稱取過量的西他沙星,置具塞三角瓶中,向其中加入純化水5 mL,平行2份,分別置于(25±2)和(37±2)℃水浴中,振搖24 h以上使平衡,得到過飽和溶液。分別取兩個溫度下的過飽和溶液適量,用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取主峰面積。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品液濃度(即平衡溶解度)。結(jié)果西他沙星在(25±2)和(37±2)℃水中平衡溶解度分別為0.33和0.44 mg·mL-1。

2.3.2 不同pH磷酸鹽緩沖液中溶解度 配制pH分別為2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2的磷酸鹽緩沖液。分別稱取過量的西他沙星,以不同pH的磷酸鹽緩沖液為溶劑,按照上述“2.3.1”項下方法操作,計算(37±2)℃西他沙星在不同pH條件下的平衡溶解度,見圖2。結(jié)果顯示,西他沙星平衡溶解度在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中最低,僅為0.13 mg·mL-1,在pH＞10及pH＜5.8的條件下平衡溶解度顯著增大。

圖2 西他沙星在不同pH磷酸鹽緩沖溶液中的平衡溶解度[(37±2)℃]Fig.2 Equilibrium solubility of sitafloxacin in different pH phosphate buffered solution[(37±2)℃]

2.4 表觀油水分配系數(shù) 精密稱取西他沙星適量,分別溶于正辛醇飽和的水以及被正辛醇飽和pH為2.0, 4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2的磷酸鹽緩沖液中,制成濃度約為0.1 mg·mL-1溶液,分別精密量取各溶液20 mL置具塞三角瓶中,然后相應(yīng)加入被水及不同pH的磷酸鹽緩沖液飽和的正辛醇20 mL,充分混合,置(37±2)℃恒溫振蕩器中,振蕩24 h以上,靜置,取下層水液10 μL,注入HPLC儀,記錄色譜圖,量取主峰面積,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算西他沙星濃度。按以下公式計算表觀油水分配系數(shù)(P):

其中P為樣品的正辛醇/水相分配系數(shù);C0為初始時水相中西他沙星濃度;Cz為達平衡后水相中西他沙星濃度;V0為初始時水相體積;V為初始時正辛醇相體積。結(jié)果見表2。

表2 西他沙星在不同溶劑中的表觀油水分配系數(shù)Tab.2 Apparentoil/waterpartitioncoefficientof sitafloxacin in different solvents

3 討論

在參考相關(guān)文獻[6]基礎(chǔ)上,筆者對西他沙星的HPLC方法進行了色譜條件篩選和方法學(xué)驗證。結(jié)果顯示,建立的HPLC方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確,可用于西他沙星的含量測定。但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)西他沙星在強光照射條件下有降解產(chǎn)物產(chǎn)生,因此在溶解度和表觀油水分配系數(shù)測定的實驗過程中應(yīng)避免強光照射。

西他沙星的臨床給藥劑型為口服固體制劑,而溶解度是影響其體外溶出和體內(nèi)吸收的重要因素,因此測定西他沙星不同溫度和不同pH條件下的溶解度,可為劑型設(shè)計和工藝參數(shù)的確定提供理論依據(jù),對于預(yù)測制劑的溶出情況及溶出介質(zhì)的選擇也有一定意義。由本研究溶解度實驗結(jié)果可知,西他沙星在水中溶解度極低,溫度升高溶解度略有提高,但仍屬極微溶。然而,隨著溶液pH向酸堿兩端變化,西他沙星的溶解度迅速增大,在pH 2.0酸性條件下溶解度約為pH 7.4中性條件下的425倍,在pH 11.0堿性條件下溶解度約為pH 7.4中性條件下的744倍。藥物在溶劑中的溶解度是藥物分子和溶劑分子間相互作用的結(jié)果,大多數(shù)藥物為有機弱酸、弱堿及其鹽類,這些藥物受pH影響較大。有機弱酸性藥物隨著溶液pH升高其溶解度增大,有機弱堿類藥物隨著溶液pH下降而升高。西他沙星的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和氨基基團,為兩性化合物,本研究中溶解度的測定結(jié)果符合其帶有酸性基團和堿性基團的特點。

油水分配系數(shù)可以反映藥物在體內(nèi)吸收的速度和程度,只有具備適當(dāng)?shù)挠退峙湎禂?shù)才能使藥物具有良好的吸收及較高的生物利用度。西他沙星在水中和不同pH磷酸鹽緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)P均＜0,說明西他沙星的脂溶性低于水溶性;一般認為有一定的脂溶性且lgP值在-1～2范圍內(nèi)藥物容易吸收,西他沙星在4.3＜pH＜10.0條件下lgP值在-1～2的范圍內(nèi),但脂溶性較差,因此推測西他沙星在人體胃腸道內(nèi)吸收度一般。但有文獻報道西他沙星口服吸收良好,生物利用度可達84%～94%[1,3],對于以被動擴散機制吸收的藥物來說,脂溶性大的易于透過細胞膜,由pH支配未解離的分子型藥物比離子型藥物易于透過細胞膜,西他沙星實際體內(nèi)生物利用度要優(yōu)于理論推測的結(jié)果,推測西他沙星口服吸收過程中不僅通過被動擴散透過生物膜,很可能還有主動轉(zhuǎn)運的參與,具體吸收機制有待細胞水平的進一步研究。

[1] 雷妮,高嵩,陳衛(wèi)東,等.西他沙星的藥理和臨床評價[J].中國臨床研究,2010,23(10):930-932.

[2] ANDERSON D L.Sitafloxacin hydrate for bacterial infections [J].Drugs Today(Barc),2008,44(7):489-501.

[3] 柴蕓,劉明亮.新氟喹諾酮類抗菌藥西他沙星[J].國外醫(yī)藥:抗生素分冊,2009,30(6):264-270.

[4] NAKASHIMA M,UEMATSU T,KOSUGE K,et al.Pharmacokinetics and tolerance of DU-6859a,a new fluoroquinolone, after single and multiple oral doses in healthy volunteers[J]. Antimicrob Agents Chemother,1995,39(1):170-174.

[5] 劉美,劉鑫榮.抗菌新藥西他沙星水合物[J].上海醫(yī)藥, 2010,31(3):122-124.

[6] 朱光宇.HPLC法測定西他沙星的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].安徽醫(yī)藥,2011,15(12):1512-1513.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.028

Determination of Solubility and Apparent Oil/Water Partition Coefficient of Sitafloxacin

DING Wei-ming,LI Gui-ling,CAI Cong,WANG Ju-xian,YANG Xin-yi
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo determine the solubility and apparent oil/water partition coefficient of sitafloxacin in different solvents.MethodsHigh performance liquid chromatography(HPLC)was used.The column was Dikma Diamonsil C18(2) (4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase was 0.05 mol·L-1KH2PO4solution(pH was adjusted with H3PO4to 2.4)-acetonitrile(70∶30).The column temperature was set at room temperature.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 295 nm and the injection volume was 10 μL.The solubility of sitafloxacin and the apparent oil/water partition coefficient at pH 2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0 and 11.2 were determined.ResultsThe equilibrium solubility of sitafloxacin in water was 0.44 mg·mL-1and the apparent oil/water partition coefficient was 0.23(lgP=-0.64)at(37±2)℃. Sitafloxacin has the lowest equilibrium solubility(0.13 mg·mL-1)and the highest apparent oil/water partition coefficient in pH7.4 buffer solution system.At pH＞10 and pH＜5.8,the solubility of sitafloxacin increased obviously and apparent oil/water partition coefficient decreased.ConclusionSitafloxacin is insoluble in water and also poorly soluble in oil,but its solubility could be improved significantly in acidic or alkaline solution.

Sitafloxacin;Solubility;Apparent oil/water partition coefficient;Chromatography,high performance liquid

R978

B

1004-0781(2014)10-1357-04

2013-09-02

2014-02-08

*中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(IMBF201201)

丁維明(1981-),女,山東龍口人,助理研究員,碩士,研究方向:藥物新劑型的研究與開發(fā)。電話:010-63181951,E-mail:weimingding@sina.com。

李桂玲(1973-),女,安徽宿州人,研究員,碩士,研究方向:藥物新劑型的研究與開發(fā)。電話:010-63181951,E-mail:liguiling1999@163.com。