超高效液相色譜法測(cè)定藿香正氣口服液中香豆素類成分的含量

何丹,楊林,張景勍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400016;2.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院,重慶 401331)

超高效液相色譜法測(cè)定藿香正氣口服液中香豆素類成分的含量

何丹1,楊林2,張景勍1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400016;2.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院,重慶 401331)

目的 建立以超高效液相色譜法(UPLC)測(cè)定藿香正氣口服液中歐前胡素和異歐前胡素含量的方法。方法色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流動(dòng)相為水-甲醇不同比例梯度洗脫,柱溫30℃,流速0.3 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm。結(jié)果歐前胡素在1.305～13.050 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程:Y=13 633X+3 976(r=0.999 9),平均回收率為99.25%,RSD=0.74%;異歐前胡素在0.596～5.960 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程:Y=10 661X+1 073(r=0.999 9),平均回收率為98.94%,RSD=0.63%。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、快速、可靠,能有效地測(cè)定藿香正氣口服液中歐前胡素和異歐前胡素的含量。

藿香正氣口服液;歐前胡素;異歐前胡素;色譜法,超高效液相

藿香正氣口服液是由蒼術(shù)、陳皮、厚樸、白芷等10味中藥制成的復(fù)方口服制劑,具有解表化濕、理氣和中之功效。用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯,夏傷暑濕,頭痛昏重,脘腹脹痛,嘔吐泄瀉,胃腸型感冒[1]。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》中藿香正氣口服液中含量測(cè)定項(xiàng)規(guī)定對(duì)厚樸酚與和厚樸酚和橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定,作為質(zhì)量控制指標(biāo)[1]。目前對(duì)“藿香正氣”類制劑含量測(cè)定方法多見(jiàn)于采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對(duì)厚樸酚、和厚樸酚、陳皮苷及百秋李醇進(jìn)行測(cè)定[2-5]。筆者未見(jiàn)對(duì)處方中白芷藥材中的香豆素類成分的含量進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道。由于香豆素類成分是白芷藥材中含量較高的活性成分之一,主要含歐前胡素和異歐前胡素,藥理活性明確,故是判別白芷藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要依據(jù)[6]。目前關(guān)于中藥材及中成藥中歐前胡素和異歐前胡素測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道主要有薄層掃描法和HPLC法[6-8],筆者未見(jiàn)采用超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法進(jìn)行測(cè)定。筆者采用UPLC法對(duì)藿香正氣口服液中的歐前胡素和異歐前胡素進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道。該方法高效、快速,重復(fù)性和精密度良好,適用于藿香正氣口服液中歐前胡素和異歐前胡素的測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC(美國(guó)Waters公司);ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)色譜柱(美國(guó)Waters公司)。

1.2 試藥 藿香正氣口服液(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠,批號(hào):11071571,11122024,12061274);歐前胡素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110826-201013);異歐前胡素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110827-200407);甲醇為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)總公司化工廠),實(shí)驗(yàn)用水為超純水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);柱溫:30℃;為避免樣品的相互干擾以及保護(hù)色譜柱,采用水-甲醇為流動(dòng)相,按表1所示梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm;流速0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量1 μL,理論板數(shù)按歐前胡素和異歐前胡素峰計(jì)算不低于3 000。

表1 水-甲醇梯度洗脫表Tab.1 Procedure of gradient elution of water-methanol

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取歐前胡素對(duì)照品0.01 305 g,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得歐前胡素對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取異歐前胡素對(duì)照品0.00 596 g,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得異歐前胡素對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 mL,置50 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得歐前胡素濃度為13.05 μg·mL-1、異歐前胡素濃度為5.96 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取藿香正氣口服液1 mL置于10 mL量瓶中,加水稀釋并定容至刻度,搖勻,用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 分別精密量取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果歐前胡素和異歐前胡素峰與其他峰分離良好,無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液1.00, 2.00,4.00,6.00,8.00,10.00 mL,置10 mL量瓶中,加水定容,搖勻,即得系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以峰面積(Y)對(duì)濃度(X,μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸。歐前胡素的回歸方程為:Y=13 633X+ 3 976(r=0.999 9);異歐前胡素的回歸方程為:Y= 10 661X+1 073(r=0.999 9)。結(jié)果表明,歐前胡素濃度在1.305～13.050 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;異歐前胡素濃度在0.596～5.960 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

A.混合對(duì)照品溶液;B.藿香正氣口服液;1.歐前胡素;2.異歐前胡素圖1 藿香正氣口服液和對(duì)照品溶液UPLC色譜圖A.mix standards solution;B.huoχiang zhengqi oral liquid;1. imperatorin;2.isoimperatorinFig.1 UPLC chromatogram of huoxiang zhengqi oral liquid and mix standards solution

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為11071571藿香正氣口服液,按供試品配制方法配制樣品溶液,按“2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積。結(jié)果歐前胡素和異歐前胡素的RSD分別為0.31%和0.42%。符合精密度實(shí)驗(yàn)要求。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為11071571藿香正氣口服液,按供試品溶液配制方法配制樣品溶液,室溫下放置0,1,2,4,6,8 h,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1 μL測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積基本不變,歐前胡素和異歐前胡素的RSD分別為0.36%和0.48%,表明溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為11071571藿香正氣口服液,按供試品配制方法平行配制6份,按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量,歐前胡素和異歐前胡素的平均含量分別為12.00 μg·mL-1和5.16 μg·mL-1,RSD分別為0.36%和0.43%。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取18份已知含量的同一批號(hào)藿香正氣口服液0.5 mL(歐前胡素含量12.00 μg·mL-1,異歐前胡素含量5.16 μg·mL-1)于10 mL量瓶中,分別精密加入相當(dāng)于制劑中歐前胡素和異歐前胡素含量的80%,100%和120%的歐前胡素和異歐前胡素對(duì)照品,按供試品溶液制備下方法制備溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣1 μL,按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果歐前胡素平均回收率99.25%,RSD= 0.74%(n=9),異歐前胡素的平均回收率98.94%, RSD=0.63%(n=9)。見(jiàn)表2。

2.9 含量測(cè)定 3批樣品按供試品溶液配制方法配制,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量,歐前胡素和異歐前胡素的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 藿香正氣口服液中歐前胡素和異歐前胡素含量測(cè)定Tab.3 Contentdeterminationofimperatorinand isoimperatorin in huoxiang zhengqi oral liquid n=3

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)測(cè)定歐前胡素的紫外吸收光譜可知:歐前胡素在260 nm以下有強(qiáng)吸收, 302 nm波長(zhǎng)處有較大吸收,《中華人民共和國(guó)藥典》及文獻(xiàn)中選用302 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)的較多,但也有選擇248 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)[9-10],本實(shí)驗(yàn)曾選用雙通道進(jìn)行測(cè)定篩選,發(fā)現(xiàn)在248 nm比在302 nm吸收更強(qiáng),且流動(dòng)相在此波長(zhǎng)處對(duì)吸收峰也無(wú)干擾,故選擇248 nm進(jìn)行測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相的選擇 關(guān)于HPLC法測(cè)定歐前胡素和異歐前胡素含量的文獻(xiàn)報(bào)道中有多種流動(dòng)相[7,11]。筆者在本實(shí)驗(yàn)曾比較乙腈-水和甲醇-水分離系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水(55∶45)可達(dá)到良好的分離效果,歐前胡素在4.1 min出峰,異歐前胡素在6.7 min出峰,峰形對(duì)稱,分離效果和柱效都比HPLC法更為好,且分析速度快。但考慮到中成藥的多組分,避免樣品間的相互干擾,同時(shí)要保護(hù)色譜柱,本實(shí)驗(yàn)在兩組分出峰后采取了梯度洗脫,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.031

Determination of Coumarin in Huoxiang Zhengqi Oral Liquid by UPLC

HE Dan1,YANG Lin2,ZHANG Jing-qing1
(1.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.School of Pharmacy,Chongqing Medical and Pharmaceutical College,Chongqing 401331, China)

ObjectiveTo establish a UPLC method for detecting content of imperatorin and isoimperatorin inhuoχiang zhengqioral liquid.MethodsACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)was used and the mobile phase was methanol and water by gradient elution mode.The column temperature was 30℃,the flow rate was 0.3 mL·min-1and the detection wavelength was 248 nm.ResultsThe linear range of imperatorin was 1.305-13.050 μg·mL-1and the regression equation was as follows:Y=13 633X+3 976(r=0.999 9).The linear range of isoimperatorin was 0.596-5.960 μg·mL-1and the regression equation wasY=10 661X+1 073(r=0.999 9).The average recovery was 99.25%(RSD=0.74%)and 98.94% (RSD=0.63%),respectively.ConclusionThe method is accurate,rapid and reliable,and can be used to determine imperatorin and isoimperatorin inhuoχiang zhengqioral liquid.

Huoχiang zhengqioral liquid;Imperatorin;Isoimperatorin;Chromatography,ultra performance liquid

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1370-03

2013-09-13

2013-11-20

何丹(1977-),女,四川達(dá)州人,講師,在讀博士,主要從事藥物分析研究。電話:(0)15310985850,E-mail:ildoctor@163.com。

張景勍(1974-),女,重慶人,研究員,博士,主要從事藥物制劑研究。電話:(0)13308300303,E-mail:zjqrae01 @163.com。