高效液相色譜法測定接骨木莖葉果實中蘆丁的含量*

胡彥武,關穎麗,張立威,王朝輝

(1.通化師范學院吉林省長白山藥用植物研究重點實驗室,通化 134002；2.通化師范學院制藥與食品科學學院,通化 134002；3.長春中醫藥大學針灸推拿學院,長春 130117)

高效液相色譜法測定接骨木莖葉果實中蘆丁的含量*

胡彥武1,2,關穎麗1,2,張立威2,王朝輝3

(1.通化師范學院吉林省長白山藥用植物研究重點實驗室,通化 134002；2.通化師范學院制藥與食品科學學院,通化 134002；3.長春中醫藥大學針灸推拿學院,長春 130117)

目的 測定接骨木莖、葉、果實等不同部位中蘆丁的含量,為接骨木資源的合理開發和綜合利用提供依據。方法采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,甲醇-0.1%磷酸水溶液(45∶55),柱溫25℃,流速為0.8 mL·min-1,檢測波長為360 nm。結果蘆丁在0.105～0.525 μg范圍內呈良好的線性關系(r= 0.999 6),平均回收率97.86%,RSD=0.49%。測得接骨木莖、葉、果實中蘆丁含量分別為0.171,0.522,0.165 mg·g-1。結論接骨木莖、葉、果實中均含有蘆丁,但差異較大,以葉中蘆丁含量最高。

接骨木;蘆丁;色譜法,高效液相

接骨木(Sambucus williamsiiHance)為忍冬科接骨木屬植物,收載于《本草綱目》中,別名馬尿騷、公道老、續骨草,其野生資源豐富,廣泛分布于我國東北、華北、西北、西南等地,具有祛風利濕、舒筋活血之功效,民間多用于風濕性關節炎、骨折、跌打損傷、痛風、大骨節病、水腫、蕁麻疹等疾病的治療。而有關接骨木的確切入藥部位,說法不一,有資料記載接骨木以莖、葉入藥[1],亦有資料稱其全株皆可入藥[2]。目前國內學者已對接骨木抗炎、促進骨折愈合等藥理作用進行報道,但與其功效相關的物質成分,筆者未見詳實報道。考慮到忍冬科其他植物中黃酮類成分含量較高,為此,本實驗以長白山區野生接骨木莖、葉、果實等不同部位為實驗材料,采用超聲提取法對其所含蘆丁成分進行提取,并以高效液相色譜(HPLC)法進行含量測定,以期了解接骨木不同藥用部位中蘆丁的含量差異,為探析接骨木中黃酮類成分的含量、篩選接骨木最佳入藥部位、深入研究接骨木中與功效相關的物質基礎提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀(四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器)；KQ-200KDB型高功率數控超聲波清洗機(昆山市超聲波儀器有限公司)；Sartorius-CP225D型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 接骨木莖、葉、果實均采自通化師范學院后山(長白山余脈),經通化師范學院制藥與食品科學學院于俊林教授鑒定為忍冬科接骨木屬植物接骨木(Sambucus williamsii)的干燥莖、葉及成熟果實；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:1097-060918)；甲醇為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司,批號:20090817),磷酸為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司,批號:20110721),水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司,批號:20121030)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(45∶55)；檢測波長為360 nm；流速0.8 mL·min-1；柱溫25℃；理論板數以蘆丁峰計算應不低于2 000。

2.2 對照品溶液制備 取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品5.25 mg,精密稱定,置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,搖勻,即得質量濃度為0.525 g·L-1的蘆丁對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取干燥接骨木莖、葉、果實粉末(過孔徑0.425 mm篩)各約1.0 g,精密稱定,分別置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇20 mL,浸泡30 min,稱定質量,溫度45℃、超聲功率100 W、頻率40 kHz條件下超聲處理20 min,放冷,再稱定質量,用甲醇補足減輕的質量,搖勻,經孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,棄初濾液,取續濾液,即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.2”項對照品溶液1 mL,置于25 mL量瓶中,甲醇定容,搖勻,吸取稀釋后的標準品溶液5,10,15,20,25 μL,在“2.1”項色譜條件下進樣并測定峰面積,并以對照品進樣量為橫坐標(X),峰面積積分值(Y)為縱坐標,進行線性回歸[3-5],得回歸方程為Y=2 011.80X-254.80,r= 0.999 6,結果表明蘆丁對照品進樣量在0.105～0.525 μg范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度實驗 精密吸取“2.2”項對照品溶液20 μL,在“2.1”項下色譜條件下進樣,連續進樣6次,并測定蘆丁色譜峰面積,結果RSD為1.31%,提示儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性實驗 精密吸取“2.3”項下同一供試品溶液(接骨木莖)20 μL,在“2.1”項色譜條件下進樣,分別在0,2,4,6,8,24 h進樣,記錄蘆丁色譜峰面積,結果RSD為1.08%,表明供試品溶液中蘆丁在24 h內穩定。

2.4.4 重復性實驗 取同一供試品(接骨木莖),按“2.3”項方法制備供試品溶液,平行操作6份,按“2.1”項色譜條件測定蘆丁含量,結果RSD為1.10%,表明方法的重復性良好。

2.4.5 加樣回收率實驗 取同一已知蘆丁含量供試品(接骨木莖,蘆丁含量為0.171 mg·g-1)6份,每份約0.5 g,精密稱定,分別加入一定量的蘆丁對照品溶液(約為樣品中蘆丁含量的1.0倍量),按“2.3”項方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進樣,每次進樣20 μL,對蘆丁進行分析,計算加樣回收率,結果見表1。蘆丁平均回收率為97.86%,RSD為0.49%,表明蘆丁的加樣回收率良好。

表1 蘆丁加樣回收率實驗結果Tab.1 Recovery results of rutin n=6

2.5 樣品含量測定 取接骨木莖、葉、果實粉末各約1.0 g,精密稱定,同一樣品平行操作3份,按“2.3”項方法制備樣品溶液,在“2.1”項色譜條件下進行檢測,接骨木莖、葉、果實中蘆丁的含量分別為0.171, 0.522,0.165 mg·g-1,RSD分別為1.14%,1.09%, 1.11%。

3 討論

本實驗采用超聲提取法首次對接骨木莖、葉、果實中蘆丁進行提取,參照《中華人民共和國藥典》2010年版中蘆丁的定量檢測方法,并結合預實驗,針對待測組分與其他組分分離情況及保留時間兩項指標,對HPLC測定蘆丁的測定條件進行了摸索,最后將色譜條件確定為:流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(45∶55),流速為0.8 mL·min-1,檢測波長360 nm,柱溫25℃。

通過本實驗研究得知,接骨木葉、莖、果實均含有蘆丁,以葉中蘆丁含量最高,其次為莖,果實中蘆丁含量較少,如以蘆丁作為質量評價依據,應主要以莖葉為接骨木的入藥部位。本研究結果印證了此前有資料報道的以接骨木莖、葉為入藥部位的觀點,進而提示,接骨木中含有的黃酮類成分可能是與祛風利濕、舒筋活血等功效相關的重要物質基礎。

[1] 嚴仲鎧,李萬林,劉桂榮,等.中國長白山藥用植物彩色圖志[M].北京:人民衛生出版社,1997:394.

[2] 南京中醫藥大學.中藥大辭典[M].2版.上海:上?？茖W技術出版社,2006:2093.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:333.

[4] 耿旦,馬雯芳,甄漢深,等.RP-HPLC測定桑椹中蘆丁的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(14):63-65.

[5] 李利華.HPLC測定魚腥草不同部位綠原酸和蘆丁的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(19):94-97.

DOI 10.3870/yydb.2014.09.031

Content Determination of Rutin in Stems,Leaves,and Fruits of Sambucus williamsii Hance by HPLC

HU Yan-wu1,2,GUAN Ying-li1,2,ZHANG Li-wei2,WANG Zhao-hui3
(1.Key Laboratory of Changbai Mountain Medicinal Plants Research of Jilin,Tonghua Normal University,Tonghua 134002,China;2.College of Pharmaceutics and Food Science,Tonghua Normal University,Tonghua 134002,China;3.College of Acupuncture and Tuina,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

Objective To determine the content of rutin in fruits,stems,and leaves ofSambucus williamsiiHance,and provide an essential reference for the exploitation and utilization of the resources.MethodsThe content of rutin was analyzed on an Agilent ZORBAX Eclispse XDB C18column(150 mm×4.6 mm,5 μm).The mobile phase was methanol-0.1%phosphoric acid(45∶55),the column temperature was set at 25℃,the flow rate was 0.8 mL·min-1,and the detection wavelength was set at 360 nm.ResultsThe linear range of rutin was 0.105-0.525 μg(r=0.999 6),the average recovery was 97.86%,and RSD was 0.49%.The content of rutin in stems,leaves,and fruits ofSambucus williamsiiHance was 0.171,0.522,and 0.165 mg·g-1,respectively.ConclusionThe stems,leaves and fruits ofSambucus williamsiiHance all contain rutin,but at a significant different content level.The leaves contain the highest level of rutin.

Sambucus williamsiiHance;Rutin;Chromatography,high performance liquid

R282.71;R927.2

B

1004-0781(2014)09-1222-03

2013-10-14

2014-01-17

*吉林省教育廳“十一五”科學技術研究項目(2008374)

胡彥武(1980-),男,吉林梨樹人,副教授,在讀博士,研究方向:生藥有效成分的分離鑒定及生物活性。電話: (0)13844545298,E-mail:hywcz@163.com。

王朝輝(1973-),女,吉林長春人,副教授,碩士生導師,博士,研究方向:中醫基礎及中藥新藥。電話:0431-86045460,E-mail:wzhqiwei@126.com。