高效液相色譜法同時測定補腎化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量*

歐陽露,夏勇,夏鵬,李洪亮,汪選斌

(1.湖北醫藥學院附屬人民醫院中藥藥理實驗室,十堰 442000；2.湖北醫藥學院藥學院,十堰 442000)

高效液相色譜法同時測定補腎化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量*

歐陽露1,2,夏勇2,夏鵬2,李洪亮1,2,汪選斌1,2

(1.湖北醫藥學院附屬人民醫院中藥藥理實驗室,十堰 442000；2.湖北醫藥學院藥學院,十堰 442000)

目的 建立高效液相色譜法同時測定補腎化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量。方法C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm),以乙腈-磷酸溶液(0.2%磷酸,pH=2.9)為流動相,梯度洗脫,流速0.8 mL·min-1,檢測波長269 nm,柱溫30℃。結果淫羊藿苷在0.3～3.0 μg范圍內線性關系良好(r=0.999 9),加樣回收率105.6%,RSD為0.95%;柚皮苷在0.12～1.20 μg范圍內線性關系良好(r=0.999 9),加樣回收率94.0%,RSD為0.52%。結論該方法操作簡便,準確穩定,重復性好,可作為補腎化瘀浸膏的質量控制標準。

補腎化瘀浸膏;柚皮苷;淫羊藿苷;色譜法,高效液相

補腎化瘀浸膏由淫羊藿(Epimedium brevicornumMaxim.)、骨碎補[Drynaria fortune(Kunze)J.Sm]等藥材組方制成,實驗研究證實,該方具有補腎壯骨、活血鎮痛之功效,對原發性骨質疏松癥有良好的治療作用,具有很高的臨床應用和開發價值[1-2]。為了保證該制劑在臨床應用安全有效,筆者參考相關文獻[3-4],建立了高效液相色譜(HPLC)法同時測定制劑中淫羊藿苷和柚皮苷含量的方法,為有效控制補腎化瘀浸膏的質量提供參考標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-20系列高效液相色譜儀:工作站LC solution,LC-20AD泵,SIL-20A自動進樣器, SPD-M20A檢測器。分析天平(FA2004型,上海天平儀器廠)。超聲波清洗機(KQ3200型,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 補腎化瘀浸膏(湖北醫藥學院附屬人民醫院提供,批號:20130226,20130311,20130319),淫羊藿苷、柚皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號分別為200415,201111),甲醇(分析純)、乙腈(色譜純),流動相用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件和系統適應性實驗 色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；梯度洗脫,流動相:磷酸溶液(0.2%磷酸,pH=2.9)-乙腈(0～13 min,體積分數為77%,～20 min,體積分數為67%,～35 min,體積分數為77%),檢測波長269 nm；流速0.8 mL·min-1；柱溫30℃；進樣量10 μL。各峰的理論板數不低于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取淫羊藿苷及柚皮苷對照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成每毫升含淫羊藿苷約0.3 mg和柚皮苷0.12 mg的溶液,搖勻即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取補腎化瘀浸膏約10 g,精密稱定,置于100 mL錐形瓶中,精密加入甲醇100 mL,精密稱定質量,超聲提取30 min,靜置放冷至室溫,以甲醇補足損失質量,濾過,續濾液用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方和工藝制法分別制備不含淫羊藿和骨碎補的陰性樣品,再按“2.2.2”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.3 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品溶液適量,加甲醇稀釋成每毫升含柚皮苷分別約為0.012,0.024,0.036,0.048,0.120 mg,含淫羊藿苷分別約為0.03,0.06,0.09,0.12,0.30 mg對照品系列溶液,各自精密吸取10 μL,注入液相色譜儀,以質量濃度對峰面積進行線性回歸,得各組分的線性范圍和回歸方程,柚皮苷在進樣量0.12～1.20 μg范圍內線性關系良好,回歸方程:Y=620 247.6X+0.479,r= 0.999 9；淫羊藿苷在進樣量0.3～3.0 μg范圍內線性關系良好,回歸方程:Y=402 191.2X-3.188,r= 0.999 9。

2.4 精密度實驗 按照“2.2.2”項下方法制備樣品溶液,按照“2.1”項色譜條件下進樣10 μL,重復6次,以淫羊藿苷和柚皮苷峰面積計算RSD,其結果分別為0.07%和0.03%,說明儀器精密度良好。

2.5 重復性實驗 取同一批補腎化瘀浸膏(批號: 20130226),按照“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液,按照“2.1”項色譜條件進樣10 μL,計算淫羊藿苷和柚皮苷含量的RSD分別為0.07%和1.62%,說明該法重復性好。

2.6 穩定性實驗 取同一樣品溶液(批號: 20130226),按照“2.1”項色譜條件分別在0,1,2,4,8, 12 h進樣10 μL,測定峰面積,計算淫羊藿苷和柚皮苷峰面積的RSD均為0.21%。表明樣品溶液在12 h內穩定性良好,可滿足測定要求。

2.7 加樣回收率實驗 取已知淫羊藿苷和柚皮苷含量的補腎化瘀浸膏6份各約10 g,精密稱定,置100 mL量瓶中,精密加入淫羊藿苷、柚皮苷對照品甲醇溶液適量,按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液,按照“2.1”項色譜條件測定含量,求得淫羊藿苷和柚皮苷的平均回收率分別為105.6%,94.0%,RSD分別為0.95%, 0.52%。見表1。

表1 淫羊藿苷和柚皮苷加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery test of naringin and icariin

2.8 專屬性考察 取“2.2.1”項對照品溶液,“2.2.2”項供試品溶液和“2.2.3”項兩種陰性樣品溶液,分別按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL,記錄色譜圖。結果,陰性樣品溶液在相應對照品溶液出峰處無吸收峰,表明其他組分對淫羊藿苷和柚皮苷的含量測定無影響。見圖1。

2.9 樣品含量測定 取3批樣品,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件進樣10 μL,計算含量,結果見表2。

3 討論

淫羊藿和骨碎補均為補腎化瘀浸膏組方中主藥,研究證實,淫羊藿和骨碎補中的黃酮類是其主要化學成分和有效成分,具有明確抗骨質疏松的藥理作用,淫羊藿苷和柚皮苷則分別是兩種藥材中主要黃酮類成分[5-6],因此選擇檢測淫羊藿苷和柚皮苷的含量作為補腎化瘀浸膏的質量控制指標。

A.骨碎補陰性對照品;B.淫羊藿陰性對照品;C.對照品;D.供試品;1.淫羊藿苷;2.柚皮苷圖1 4種溶液的HPLC色譜圖A.Negative control of Drynaria fortune(Kunze)J.Sm；B.negative control of Epimedium brevicornum Maxim；C.control；D.sample；1.naringin；2.icariinFig.1 HPLC chromatography of four kinds of solution

表2 3批樣品中柚皮苷和淫羊藿苷含量測定結果Tab.2 Result of content determination of icariin and naringin on three samples n=3

為了使淫羊藿苷和柚皮苷能夠良好地分離,本實驗對色譜條件進行了考察。結果表明,以乙腈-醋酸銨水溶液為流動相(27∶73)時,二者能夠達到較好的分離,但淫羊藿苷峰附近出現干擾峰,更換流動相為乙腈-磷酸水溶液,且采用梯度洗脫,不僅能使二者有效分離,還能消除雜質對被測成分的干擾,同時節省了時間和溶劑。淫羊藿苷和柚皮苷的最大吸收波長分別為270和285 nm,本實驗考察發現在269 nm單一波長下,淫羊藿苷和柚皮時能同時得到較好的色譜峰,因此選擇269 nm作為檢測波長。

筆者建立的含量測定方法,操作簡便,準確穩定,重復性好,可作為補腎化瘀浸膏的質量控制標準。

[1] 歐陽露,汪選斌,國宏莉,等.補腎化瘀浸膏對去勢大鼠骨密度及骨組織形態的影響[J].醫藥導報,2009,28(12): 1533-1535.

[2] 歐陽露,汪選斌,肖雨清,等.補腎化瘀浸膏對去勢大鼠血清ALP、E2及IL-6水平的影響[J].中國藥師,2009,12 (10):1342-1344.

[3] 萬婷,熊富良,高文天,等.骨康膠囊的質量控制研究[J].中成藥,2012,34(6):1096-1099.

[4] 韓麗萍,陳行愉,劉志剛.HPLC法同時測定抗骨質疏松中成藥中柚皮苷及淫羊藿苷的含量[J].中國藥房,2010,21 (43):4083-4085.

[5] PEI L K,SUN S Q,GUO B L,et al.Fast quality control of HerbaEpimediibyusingFouriertransforminfrared specroscopy[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2008,70(2):258-264.

[6] 彭雙,韓立峰,王濤,等.骨碎補中的化學成分及藥理作用研究進展[J].天津中醫藥大學學報,2012,31(2):122-125.

DOI 10.3870/yydb.2014.09.032

Simultaneous Determination of Icariin and Naringin in Bushen Huayu Extract by HPLC

OUYANG Lu1,2,XIA Yong2,XIA Peng2,LI Hong-liang1,2,WANG Xuan-bin1,2
(1.Laboratory of Chinese Herbal Pharmacology,Affiliated People’s Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;2.School of Pharmacy,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

Objective To establish a method for simultaneous determination of icariin and naringin content inbushen huayuextract by HPLC.MethodsReverse-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC)separation was performed one C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase was acetonitrile containing 0.2%H3PO4(pH=2.9). Gradient elution with a flow rate of 0.8 mL·min-1was applied to achieve the separation.The detection wavelength was set at 269 nm,and the column temperature was 30℃.ResultsIcariin had a good linear range from 0.3-3.0 μg(r=0.999 9). The recovery rate was 105.6%,and RSD was 0.95%.Naringin was linear within the range of 0.12-1.20 μg(r=0.999 9).The recovery rate was 94.0%and RSD was 0.52%.ConclusionThe method is simple,stable,accurate,and reproducible,which can be used as the quality control standard forbushen huayueextract.

Bushen huayuextract;Icariin;Naringin;Chromatography,high performance liquid

R286；R927.2

B

1004-0781(2014)09-1224-03

2013-07-10

2013-10-30

*十堰市科學技術研究與開發項目(ZD2011023)；湖北省教育廳項目(B20082412)；湖北省2011協同創新中心基金資助項目(4)

歐陽露(1972-),女,湖北監利人,副主任藥師,副教授,碩士,研究方向:中藥新制劑研發。電話:0719-8637260,E-mail:ouyanglu-sy@163.com。

汪選斌(1971-),男,湖北十堰人,主任藥師,教授,博士,研究方向:中藥藥理。電話:0719-8843185,E-mail: xuanbin.w@163.com。