Caspase-3抑制藥對(duì)甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織NO和SOD及MDA的影響*

李新新，楊秀麗，陳曉雷，郝偉，王一然

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.法醫(yī)司法鑒定所；2.機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110034；3.遼寧省法庫(kù)縣公安局，法庫(kù) 110400)

Caspase-3抑制藥對(duì)甲基苯丙胺依賴大鼠腦組織NO和SOD及MDA的影響*

李新新1，楊秀麗1，陳曉雷1，郝偉2，王一然3

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.法醫(yī)司法鑒定所；2.機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110034；3.遼寧省法庫(kù)縣公安局，法庫(kù) 110400)

目的 觀察Caspase-3抑制藥對(duì)甲基苯丙胺(MA)慢性依賴大鼠腦組織損傷的干預(yù)與保護(hù)作用。方法建立MA慢性依賴大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,側(cè)腦室注射Caspase-3抑制藥(z-DEVD-fmk),檢測(cè)各組大鼠腦組織海馬區(qū)一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的變化及三者之間的關(guān)系。結(jié)果MA慢性依賴組腦組織海馬區(qū)NO、MDA明顯升高,SOD含量減少;MA+z-DEVD-fmk干預(yù)組NO、MDA含量升高減少,SOD活性下降減弱,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論Caspase-3抑制藥能夠降低MA慢性依賴大鼠腦組織海馬區(qū)NO、MDA含量,并使SOD含量升高,對(duì)大鼠腦組織損傷有一定的干預(yù)與保護(hù)作用。

甲基苯丙胺；Caspase-3抑制藥；一氧化氮；超氧化物歧化酶；丙二醛

甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)屬于苯丙胺類興奮劑,長(zhǎng)期濫用可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)病理和行為的改變,對(duì)動(dòng)物及人類大腦多巴胺(dopamine,DA)或5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)能神經(jīng)元具有毒性作用〔1〕。筆者在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)建立MA慢性依賴動(dòng)物模型,觀察在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3)抑制藥z-DEVD-fmk干預(yù)下大鼠腦組織中一氧化氮(nitric oxide,NO)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量變化及相互關(guān)系,為進(jìn)一步探索MA依賴的干預(yù)和治療提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠(沈醫(yī)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào): 0008180),體質(zhì)量180～230 g,雌雄各半,均由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,許可證號(hào):SCXK(遼) 2010-0001。

1.2 藥品與試劑 MA由丹東市公安局提供(純度: 70%)；Caspase-3抑制藥z-DEVD-fmk購(gòu)于德國(guó)默克公司(批號(hào):DOO99483)；NO試劑盒(批號(hào):20110709)、SOD試劑盒(批號(hào):20111208)和MDA試劑盒(批號(hào): 20110818)均由南京建成生物工程研究所提供,水合氯醛(批號(hào):20100709)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器 大鼠腦立體定位儀(美國(guó)SAI公司),腦微量進(jìn)樣系統(tǒng)(深圳瑞沃德生命科學(xué)有限公司)。

1.4 動(dòng)物分組與模型的建立 取Sprague-Dawley(SD)大鼠80只,體質(zhì)量180～230 g,在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,行側(cè)腦室插管手術(shù)[2]。將動(dòng)物腹腔注射水合氯醛(40 mg·kg-1)麻醉后,固定于大鼠腦立體定位儀上,調(diào)節(jié)定位儀使動(dòng)物頭部左右對(duì)稱,前后囟處于同一水平面上,沿顱頂正中剪開(kāi)頭皮暴露顱骨。根據(jù)Paxinos&Wastson大鼠腦圖譜[3]確定側(cè)腦室(前囟后0.8 mm,向右旁開(kāi)1.5 mm,硬腦膜下4.5 mm)位置。用12號(hào)粗針在此位置上方顱骨相應(yīng)部位刺一小孔(孔徑約2 mm),將腦微量進(jìn)樣系統(tǒng)(外徑約0.56 mm)置于腦室內(nèi)。用502膠水和牙科水泥將套管固定于顱骨上,用一不銹鋼管心針插入套管內(nèi),防止套管堵塞。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng),至少恢復(fù)7 d,恢復(fù)期間,觀察記錄動(dòng)物的一般情況。將術(shù)后存活的大鼠70只隨機(jī)分為4組(空白對(duì)照組10只,其他每組20只):①空白對(duì)照組每日腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；②MA依賴組；③z-DEVD-fmk+ MA組；④z-DEVD-fmk組[20 μg·(100g)-1]。參照文獻(xiàn)[3]方法,MA以劑量逐日遞增法按照0.5,1,2,8,10, 15和20 mg·kg-1的劑量逐日遞增,bid(8∶00,20∶00),從第8天開(kāi)始維持20 mg·kg-1的劑量造MA慢性依賴動(dòng)物模型,腹腔注射給藥。z-DEVE-fmk+MA實(shí)驗(yàn)組在劑量逐日遞增給予MA造模的同時(shí),每天一次腦室注射z-DEVD-fmk,劑量為20 μg·kg-1,用干預(yù)性治療。術(shù)后每天均自由飲水,進(jìn)食,并每天進(jìn)行給藥后1 h的行為學(xué)觀察。術(shù)后開(kāi)始按上述劑量逐日遞增用藥14 d結(jié)束后,斷頭處死動(dòng)物,快速開(kāi)顱取腦,所取腦組織按文獻(xiàn)[4]方法冰上分離海馬區(qū),制備腦組織勻漿。

1.5 腦組織海馬區(qū)NO、SOD和MDA測(cè)定 NO采用硝酸還原酶法,SOD采用亞硝酸鹽顯色法,MDA采用硫代巴比妥(TBA)法,采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。其中對(duì)大鼠腦中NO和MDA含量的測(cè)定,是將大鼠腦組織制成10%的勻漿；對(duì)大鼠腦中SOD活力的測(cè)定,是將腦組織制成1%的勻漿。檢測(cè)方法按試劑盒操作。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織海馬區(qū)NO含量的變化 MA組和z-DEVD-fmk+MA組腦組織海馬區(qū)NO含量上升,與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。MA組與z-DEVD-fmk+MA組比較NO含量上升較少,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠腦組織海馬區(qū)NO含量比較Tab.1 Comparison of NO content in hippocampus of four groups of rats ±s

表1 4組大鼠腦組織海馬區(qū)NO含量比較Tab.1 Comparison of NO content in hippocampus of four groups of rats ±s

與空白對(duì)照組比較,*1P＜0.01;與z-DEVD-fmk+MA組比較,*2P＜0.01Compared with blank control group,*1P＜0.01;compared with z-DEVD-fmk plus MA group,*2P＜0.01

組別大鼠/只NO/(μmol·L-1) z-DEVD-fmk+MA組105.34±0.24*1z-DEVD-fmk組104.48±0.23*1MA組106.27±0.14*1*2空白對(duì)照組104.81±0.21

2.2 大鼠腦組織海馬區(qū)SOD和MDA的含量 MA組和z-DEVD-fmk+MA組腦組織海馬區(qū)均有MDA含量上升、SOD活性下降,與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),MA組與z-DEVD-fmk+MA組比較MDA含量上升較少,SOD含量下降較弱,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠腦組織海馬區(qū)SOD活性和MDA含量的比較Tab.2 Comparison of SOD and MDA content in hippocampus of four groups of rats ±s

表2 4組大鼠腦組織海馬區(qū)SOD活性和MDA含量的比較Tab.2 Comparison of SOD and MDA content in hippocampus of four groups of rats ±s

與空白對(duì)照組比較,*1P＜0.01;與z-DEVD-fmk+MA組比較,*2P＜0.01Compared with blank control group,*1P＜0.01;compared with z-DEVD-fmk plus MA group,*2P＜0.01

組別大鼠/只SOD/(U·mL-1) MDA/(nmol·mL-1) z-DEVD-fmk+MA組10231.58±9.01*131.64±4.05*1z-DEVD-fmk組10307.52±11.8328.43±2.70 MA組10214.61±11.37*1*237.21±4.51*1*2空白對(duì)照組10312.98±12.6328.18±3.80

3 討論

NO是一種自由基氣體,在體內(nèi)有較廣泛的生物學(xué)效應(yīng),具有細(xì)胞毒作用,通過(guò)多種途徑引起神經(jīng)細(xì)胞的直接損害,包括DNA的損傷。此外,NO可引起細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高,GMP依賴性蛋白激酶,導(dǎo)致蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化,生成更多的NO,導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂或細(xì)胞凋亡。

當(dāng)體內(nèi)自由基過(guò)多時(shí)可引起機(jī)體組織細(xì)胞損傷,導(dǎo)致多種疾病發(fā)生和發(fā)展甚至死亡,自由基是生物體產(chǎn)生并損害自身的毒性產(chǎn)物,可引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)并產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物[5],其毒性作用最大,它的含量反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的速率及強(qiáng)度,可間接反映組織受自由基損傷的程度。SOD是一種重要的抗氧化酶,可以清除超氧陰離子自由基,保護(hù)生物體免受自由基的攻擊,對(duì)機(jī)體的氧化及抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用,SOD含量的高低間接反映了機(jī)體清除自由基的能力[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)研究MA慢性依賴組大鼠腦組織中NO和MDA含量升高,SOD含量下降,可見(jiàn)MA對(duì)大鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞損傷較大,在給予Caspase-3抑制藥z-DEVD-fmk干預(yù)后MA慢性依賴大鼠腦組織中NO和MDA含量升高較少,SOD含量升高明顯,說(shuō)明Caspase-3抑制藥對(duì)MA慢性依賴組大鼠腦神經(jīng)組織有一定的保護(hù)作用。Caspase基因家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中有非常重要的作用[8],在瀑布式活化后降解其底物,使一系列細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞修復(fù)酶等裂解,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。其中,Caspase-3被認(rèn)為是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶。Caspase-3抑制藥是一種多肽類特異性Caspase-3抑制藥,因其具有一定的毒副作用,目前只作為實(shí)驗(yàn)研究用藥,通過(guò)特異的抑制Caspase-3蛋白酶的活性可阻止細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說(shuō)明Caspase-3抑制藥在抑制Caspase-3蛋白酶的活性阻止細(xì)胞凋亡的同時(shí)也可減少NO、MDA對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷,并提高了SOD清除自由基的能力。但這一作用是通過(guò)哪些途徑進(jìn)行的還有待于進(jìn)一步研究。

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[5] 高偉敏,任今今,楊永濱.清熱止瀉方治療急性放射性腸炎的作用機(jī)制[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,32(7):878-881.

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.004

Effect of Caspase-3 Inhibitor on Content of NO,SOD and MDA in Methamphetamine-Dependent Rat Brain

LI Xin-xin1,YANG Xiu-li1,CHEN Xiao-lei1,HAO Wei2,WANG Yi-ran3
(1.Forensic Assay Office;2. Department of Functional Eχperiment Center of Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China;3.Faku Public Security Bureau,Faku 110400,China)

Objective To study the intervention and protective effect of Caspase-3 inhibitor on damaged brain tissues of methamphetamine-dependent rats.MethodsThe chronic methamphetamine-dependent rat model was established.Caspase-3 inhibitor(z-DEVD-fmk)was injected into lateral ventricles to determine the changes of NO,SOD and MDA of the hippocampus in the rats.ResultsNO and MDA were significantly increased,and SOD decreased in the hippocampus of the chronic methamphetamine-dependent rats.NO and MDA were slightly increased and SOD slightly decreased in the MA+z-DEVD-fmk plus methamphetamine-dependent rats.There was significant difference between the two groups(P＜0.01).ConclusionThe caspase-3 inhibitor can reduce the expression of NO and MDA,and increase the expression of SOD in the hippocampus of the chronic methamphetamine-dependent rats.The caspase-3 inhibitor exerts protective effect on rat brain.

Methamphetamine;Inhibitor of caspase-3;Nitric oxide;Superoxide dismutase;Malondialdehyde

R971.7;R965

A

1004-0781(2014)04-0426-03

2013-04-17

2013-10-25

*遼寧省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2011225020)

李新新(1960-),女,遼寧沈陽(yáng)人,教授,學(xué)士,研究方向:法醫(yī)臨床學(xué)教學(xué)、檢案和科研工作。電話:(0) 18940115898,E-mail：Lixinxin9192000@yahoo.com.cn。