氧化苦參堿對肝硬化大鼠腸源性內毒素血癥的影響

朱方擎，陳衛國，陳杰，林浩，劉立璽，龔敏，文萍，文劍波

(南方醫科大學附屬萍鄉醫院 1.消化內科；2.藥學部，萍鄉 337000)

氧化苦參堿對肝硬化大鼠腸源性內毒素血癥的影響

朱方擎1，陳衛國1，陳杰2，林浩1，劉立璽1，龔敏1，文萍1，文劍波1

(南方醫科大學附屬萍鄉醫院 1.消化內科；2.藥學部，萍鄉 337000)

目的 探究氧化苦參堿對肝硬化大鼠腸源性內毒素血癥的影響。方法使用四氯化碳(CCl4)進行肝硬化大鼠模型制備,30只制備成功的肝硬化大鼠隨機分成兩組:治療組接受氧化苦參堿肌內注射(63 mg·kg-1);模型組接受同等劑量5%葡萄糖溶液肌內注射。另取10只健康大鼠作為正常組。實驗結束后,取大鼠門靜脈血,使用鱟試劑盒,運用動態濁度法對血漿樣品進行內毒素檢測;取末段回腸組織,用ELISA試劑盒進行腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)濃度的測定,并進行光學顯微鏡下回腸組織病理學觀察。結果模型組內毒素水平明顯高于正常組,氧化苦參堿治療后,治療組內毒素水平明顯下降,與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。與模型組比較,治療組回腸組織中TNF-α和IL-6的濃度顯著下降(P＜0.01)。模型組大鼠腸黏膜絨毛萎縮、脫落、斷裂,黏膜固有層甚至肌層可見炎細胞浸潤,絨毛水腫嚴重,并可見肌層組織水腫疏松;治療組腸黏膜得到修復,絨毛整齊,水腫減輕,黏膜層致密,浸潤的炎細胞明顯減少。結論氧化苦參堿能降低肝硬化大鼠腸黏膜組織細胞因子TNF-α、IL-6的濃度水平,改善腸黏膜屏障功能,從而減輕腸源性內毒素血癥。

氧化苦參堿；肝硬化；內毒素血癥；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6

肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病,由一種或多種病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損害。早期由于肝臟代償功能較強可無明顯癥狀,后期則以肝功能損害和門靜脈高壓為主要表現,并有多系統受累,晚期常出現上消化道出血、肝性腦病、繼發感染、腹腔積液、肝腎綜合征等并發癥。研究證實,腸源性內毒素血癥與肝硬化上述并發癥的發生關系密切[1]。大多數肝硬化患者可出現腸黏膜屏障功能損傷,使得腸源性內毒素透過腸黏膜屏障進入血液循環,形成腸源性內毒素血癥[2]。因此,尋找有效的治療方法來減輕肝硬化患者的內毒素血癥日益受到重視。氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是傳統中藥草本苦參中的提取物,有多種藥理作用,抗炎作用是其最重要的藥理作用之一[3]。研究表明,OMT能抑制各種大鼠模型中細胞因子釋放[3-5]。因此,筆者假設OMT能通過抗炎作用保護腸黏膜屏障功能,從而減輕腸源性內毒素血癥。因而,筆者探討OMT在肝硬化腸源性內毒素血癥中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 50只SPF級雄性SD大鼠(合格證號: 4304701345),體質量180～220 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗動物生產許可證:SCXK(滬)2003-0003；實驗動物使用許可證:SYXK(蘇)2002-0123。四氯化碳(CCl4)溶液和醫用橄欖油購自上海國藥集團化學試劑有限公司；內毒素檢測鱟試劑盒(批號:130308)購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)ELISA檢測試劑盒(批號: E02T0008、E02I0006)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；苦參素注射液(批號:130312102)由江蘇正大天晴藥業集團股份有限公司提供,規格:2 mL∶0.6 g。

1.2 造模、分組、藥物注射 取40只正常大鼠進行肝硬化造模,采用40%CCl4橄欖油溶液(按2∶3比例配置)0.3 mL·kg-1,皮下注射,每周2次,按個體化原則,每只大鼠根據自身體質量調整劑量,共12周[6]。最后制成肝硬化大鼠共30只,肝臟病理圖片見圖1。另取10只正常大鼠標記為正常組(n=10)。造模成功大鼠分為模型組(n=15)和治療組(n=15)。治療組大鼠接受5%葡萄糖溶液配置的OMT肌內注射(63 mg·kg-1)共4周,qd；正常組和模型組大鼠分別肌內注射同等劑量5%葡萄糖溶液4周,qd。與此同時,模型組與治療組大鼠繼續接受40%CCl4橄欖油溶液皮下注射至16周。16周實驗周期結束后,所有大鼠使用3%水合氯醛進行麻醉并解剖。收集門靜脈血樣品進行保存,并取末段回腸組織存儲于液氮罐中備用。

圖1 大鼠肝臟HE染色病理圖片(A.×40;B.×200)Fig.1 Hematoxylin and eosin staining of liver tissue (A.×40；B.×200)

1.3 血漿內毒素水平測定 使用內毒素檢測鱟試劑盒,運用動態濁度法對血漿樣品進行內毒素檢測。采集2 mL以上的靜脈血3 000 r·min-1離心60 s。取0.1 mL樣本上清液,加入0.9 mL樣本處理液中,混勻后70℃加熱10 min,之后立即冰浴3 min。取0.2 mL樣本混合液加入鱟試劑中,混勻后移取0.1 mL至96微孔板中上機檢測。

1.4 檢測回腸組織中TNF-α和IL-6的濃度 采用ELISA的方法檢測回腸組織中TNF-α和IL-6的濃度。將冰凍保存的回腸組織剪成碎片,加入預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)液中并進行勻漿,然后用離心機5 000 r·min-1離心15 min,取上清液作為待測標本。TNF-α和IL-6濃度檢測嚴格按照試劑盒說明書進行操作,并根據檢測結果作出標準曲線,計算出標本濃度。

1.5 回腸組織病理學觀察 對末段回腸組織樣品進行常規組織病理學觀察。使用0.9%氯化鈉溶液清洗回腸組織,然后用10%甲醛溶液固定,常規石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下對黏膜損傷程度進行評估,觀察絨毛排列是否整齊,黏膜有無水腫及炎細胞浸潤程度等。

1.6 統計學方法 用SPSS16.0版統計學軟件進行分析,數據以均數±標準差(±s)表示。TNF-α和IL-6數據為計量資料,組間比較示方差齊,行單因素方差分析,均數間多重比較采用SNK檢驗(Student-Newman-Keuls)；血漿內毒素數據為等級資料,使用秩轉換非參數統計方法中的H檢驗法(Kruskal-Wallis H test)進行比較,組間兩兩比較使用Nemenyi檢驗法,以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿內毒素水平 見表1。模型組的內毒素水平明顯高于正常組,組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)。模型組中有13只大鼠內毒素水平＞0.035 EU·mL-1,而治療組中僅為7只,OMT治療后,治療組內毒素水平顯著下降,與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

表1 3組大鼠血漿內毒素水平比較Tab.1 Comparison of the serum endotoxin levels among three groups of rats 只

2.2 回腸組織中TNF-α和IL-6濃度水平 與正常組比較,模型組TNF-α和IL-6濃度水平明顯升高(P＜0.01)。OMT治療后,治療組TNF-α和IL-6濃度水平顯著下降,與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01),見表2。

表2 3組大鼠回腸組織中TNF-α和IL-6濃度比較Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in ileal tissue among three groups of rats pg·mL-1,±s

表2 3組大鼠回腸組織中TNF-α和IL-6濃度比較Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in ileal tissue among three groups of rats pg·mL-1,±s

與模型組比較,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

組別大鼠/只TNF-αIL-6治療組1597.83±17.79*178.07±24.94*1模型組15152.52±15.81118.82±35.71正常組1048.63±18.73*150.88±22.13*1

2.3 回腸組織病理學改變 正常組腸壁組織黏膜完整,絨毛排列整齊,腸黏膜僅有少量炎細胞浸潤(圖 2A)。模型組大鼠腸黏膜可見絨毛萎縮、變短、斷裂,并可見大量炎細胞浸潤于黏膜固有層甚至肌層；另外,可見絨毛嚴重水腫,黏膜層組織疏松(圖2B)。經過OMT治療后,治療組大鼠腸黏膜絨毛整齊,水腫減輕,黏膜層更致密,浸潤的炎細胞明顯減少(圖2C)。

3 討論

研究證實,OMT能抑制各種大鼠模型細胞因子釋放,包括創傷性腦損傷、葡聚糖硫酸鹽鈉誘導結腸炎、腸道缺血-再灌注損傷和急性胰腺炎等模型[3-5]。雖然OMT有抗炎治療效果,但筆者未見OMT減少肝硬化大鼠腸黏膜中細胞因子的研究。本實驗中,筆者假設OMT能夠減少肝硬化大鼠腸道組織中TNF-α和IL-6發揮其抗炎作用,從而改善腸黏膜屏障功能,減輕腸源性內毒素血癥。

A.正常組;B.模型組;C.治療組圖2 大鼠回腸病理切片(HE,×200)A.control group；B.model group；C.treatment groupFig.2 Hematoxylin and eosin staining of ileal tissue(HE,×200)

肝硬化腸黏膜屏障功能損傷的確切機制尚未闡明,但細胞因子在損傷中起了至關重要作用。在大量促炎遞質中,TNF-α在腸屏障功能的生理調節中起重要作用[7-8]。此外,TNF-α可能是誘導諸如IL-6、IFN-γ等多種細胞因子產生的遞質,而這些細胞因子將加重腸屏障損傷。YANG等[6]研究結果證實了丹參多酚酸鹽通過抑制TNF-α和IL-6 mRNA的表達修復了肝硬化大鼠腸黏膜的損傷。這表明TNF-α在腸黏膜屏障功能的損害中起了重要作用。除此之外,IL-6也是腸黏膜屏障損害的重要炎癥因子。DU PLESSIS等[9]的研究表明,肝硬化時腸道巨噬細胞呈激活表型,將引起iNOS表達和NO、IL-6分泌,從而破壞腸黏膜屏障功能。近來,有研究表明,IL-6能改變培養的腸上皮細胞緊密連接蛋白Claudin-2的表達和腸道通透性,這闡明了腸道局部炎癥和腸道通透性的確切關聯[10]。因此, TNF-α和IL-6是肝硬化腸黏膜屏障損傷中的重要炎癥因子。本實驗中,筆者觀察到模型組腸道組織中TNF-α、IL-6濃度水平明顯提高,腸黏膜屏障功能損害嚴重,腸源性內毒素血癥嚴重；經過OMT治療后,TNF-α、IL-6濃度水平顯著下降,腸黏膜屏障功能得到改善,腸源性內毒素血癥減輕。

總之,OMT通過降低腸黏膜細胞因子TNF-α、IL-6的濃度水平,改善腸黏膜屏障功能,從而減輕腸源性內毒素血癥。此外,OMT可能具有對腸道內毒素的直接清除作用,從而減少腸源性內毒素血癥的發生。當然, OMT減輕腸源性內毒素血癥的確切機制有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.04.007

Effect of Oxymatrine on Enterogenous Endotoxemia in Cirrhotic Rats

ZHU Fang-qing1,CHEN Wei-guo1,CHEN Jie2,LIN Hao1,LIU Li-xi1,GONG Min1,WEN Ping1,WEN Jian-bo1
(1.Department of Gastroenterology;2.Department of Pharmacy,The Affiliated Pingχiang Hospital of Southern Medical University,Pingχiang 337000,China)

Objective To investigate the effect of oxymatrine on enterogenous endotoxemia in rats with cirrhosis.MethodsThirty rats with carbon tetrachloride(CCl4)-induced cirrhosis were randomly divided into two groups:the treatment group,who received oxymatrine intramuscular injection(63 mg·kg-1);and the model control group,who received the same volume of 5%glucose solution.Another 10 healthy rats served as the normal control group.At the end of the experiment,serum samples were taken from the portal vein for the detection of endotoxin level with a Kinetic Turbidimetric Limulus Amebocyte Lysate Kit.Concentration of TNF-α and IL-6 in the ileum tissue was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). A piece of terminal ileum was also sampled for histopathologic examination.ResultsThe serum endotoxin level was significantly elevated in the model control group than the normal control group.After the treatment with oxymatrine,the serum endotoxin level was significantly decreased compared with the model control(P＜0.01).Administration of oxymatrine resulted in a significant reduction in the concentration of TNF-α and IL-6 compared with the model control group(P＜0.01).The intestinal mucosal villi in rats of the model control group were atrophic,shorter,fractured,and infiltrated with inflammatory cells into the lamina propria and even muscular layer.The swelling of the villi was serious and structure of mucous membrane became loose. This observation was reversed in the treatment group.ConclusionOxymatrine decreased enterogenous endotoxemia in cirrhotic rats by reducing the concentration of TNF-α and IL-6 and improving intestinal barrier function.

Oxymatrine;Cirrhosis;Endotoxemia;Tumor necrosis factor-α;Interleukin-6

R287;R285.5

A

1004-0781(2014)04-0438-04

2013-10-15

2014-01-20

朱方擎(1989-),男,江西贛州人,在讀碩士,研究方向:肝硬化腸黏膜屏障功能。電話:0799-6881797,E-mail：195375529@qq.com。

文劍波(1963-),男,江西萍鄉人,碩士生導師,研究方向:腸黏膜屏障功能。電話:0799-6881797,E-mail：wenjbpx@126.com。