高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣中間體L1的相關物質

任漢城，趙海龍

(浙江金立源藥業有限公司，上虞 312300)

高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣中間體L1的相關物質

任漢城，趙海龍

(浙江金立源藥業有限公司，上虞 312300)

目的 建立高效液相色譜法測定阿托伐他汀鈣中間體L1的有關物質。方法采用Agilent Poroshell ECC18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm),以水∶乙腈∶四氫呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6,為流動相,流速為0.7 mL·min-1,檢測波長為246 nm,柱溫為30℃。結果阿托伐他汀鈣中間體L1和已知雜質L1-雙胺、L1-脫氟、L1-R,S、L1-雙氟互相之間分離度良好,L1-雙胺在0.124 1～1.488 0 μg·mL-1的濃度范圍內呈良好的線性關系(R2=0.999 5,n=7),L1-脫氟在0.386 6～3.093 0 μg·mL-1的濃度范圍內呈良好的線性關系(R2=1,n=6),L1-R,S在0.357 1～2.856 0 μg·mL-1的濃度范圍內呈良好的線性關系(R2=0.999 0,n=6),L1-雙氟在0.187 3～1.498 0 μg·mL-1的濃度范圍內呈良好的線性關系(R2=0.999 3,n=6),各雜質的控制限度均達到定量限。結論該方法各雜質及中間體L1互相之間分離度良好,方法準確、可靠。

阿托伐他汀鈣中間體；色譜法,高效液相；有關物質

阿托伐他汀鈣是由美國Warner-Lambert公司和Pfizer公司于1997年共同開發上市的調血脂藥,因其能夠同時降低總膽固醇和低密度脂蛋白的含量,具有高活性、低毒、低副作用等優點,是市場上銷售最好的HMG-CoA還原酯抑制藥。連續7年全球年銷售額達百億,其研究愈發引起人們關注[1]。中間體L1被廣泛用于合成該藥,中間體L1分子式為C11H17N3,化學名為(4R-cis)-6-[2-[2-(4-氟苯基)-5-(1-異丙基)-3-苯基-4-[(苯胺)羰基]-1H-吡咯-1-基]乙基]-2,2-二甲基-1,3-二氧六環-4-乙酸叔丁酯?？刂坪闷滟|量是確保阿托伐他汀鈣相關雜質低和產品純度高的必要前提,對于阿托伐他汀鈣原料藥生產過程的控制具有較重要的意義。張明穎等[2]建立了關于阿托伐他汀鈣中間體L1有關物質的檢測方法,但作者只驗證了主峰L1的專屬性,并未考察4種已知雜質L1-雙胺、L1-R,S、L1-脫氟、L1-雙氟相互之間的分離度,方法有待進一步改進。筆者未見國內及國外關于L1有關物質檢查的詳細方法及其驗證的報道。其中L1與L1-R,S由于結構極其相似,分離難度極大,筆者建立了一個良好的分離方法,方法專屬性強,4種已知雜質及L1相互之間分離度良好,各雜質與未知雜質之間的分離度也均大于1.0,能有效地控制產品質量。

1 實驗材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器)。L1、L1-R,S、L1-脫氟、L1-雙氟、L1-雙胺均為公司自制并已做結構確證,含量按色譜純度計,分別為99.09%,96.21%,100.0%,99.09%,97.53%；阿托伐他汀鈣中間體L1(公司自制,批號:20100701)；乙腈、甲醇、四氫呋喃均為色譜級；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適應性實驗 色譜柱:Agilent Poroshell EC-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)；流動相:水∶乙腈∶四氫呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6)；流速:0.7 mL·min-1；檢測波長:246 nm；柱溫:30℃；進樣量:10 μL；溶劑:乙腈∶水(80∶20)；理論板數按L1計不少于18 000。

2.2 專屬性考察 分別配制溶劑、0.5 mg·mL-1L1供試品溶液及L1與4個雜質的混合溶液(0.5 mg·mL-1L1+0.3%L1-R,S+0.3%L1-脫氟+ 0.15%L1-雙氟+0.10%L1-雙胺)各10 μL,在上述色譜條件下進行測定。結果溶劑、L1及4種已知雜質均得到良好分離。見圖1。

2.3 線性關系考察 取4種雜質樣品適量,加溶劑溶解并稀釋成含L1-R,S2.856 0 μg·mL-1、L1-雙胺0.992 9 μg·mL-1、L1-脫氟3.093 0 μg·mL-1、L1-雙氟1.498 0 μg·mL-1的混合溶液作為200%濃度溶液,依次稀釋成150%、100%、75%、50%、25%濃度溶液,取L1-雙胺適量加溶劑溶解并稀釋成1.488 0 μg·mL-1的溶液,分別以10 μL進樣,以濃度(C,μg·mL-1)對峰面積(A)進行線性回歸,線性方程分別為:

結果表明L1-雙胺在0.124 1～1.488 0 μg·mL-1的濃度范圍內與峰面積線性關系良好；L1-脫氟在0.386 6～3.093 0 μg·mL-1的濃度范圍內與峰面積線性關系良好；L1-R,S在0.357 1～2.856 0 μg·mL-1的濃度范圍內與峰面積線性關系良好；L1-雙氟在0.187 3～1.498 0 μg·mL-1的濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4 精密度實驗 取線性關系考察實驗中的100%溶液,按樣品測定方法,重復測定6次,以峰面積計算: RSDL1-雙胺為2.20%,RSDL1-脫氟為0.79%,RSDL1-R,S為0.93%,RSDL1-雙氟為4.17%,均小于5.0%。

2.5 檢測限(limit of detection,LOD)及定量限(limit of quantitation,LOQ) 以信噪比3為LOD,以信噪比10為LOQ,L1-R,S的LOD為0.632 8 ng,LOQ為2.848 ng；L1-脫氟的LOD為0.685 1 ng,LOQ為3.083 ng；L1-雙氟的LOD為0.996 4 ng,LOQ為3.736 ng；L1-雙胺的LOD為0.992 8 ng,LOQ為3.723 ng。

2.6 回收率實驗 精密稱取阿托伐他汀鈣中間體L1約25 mg 10份,精密加入各雜質混合溶液(80%, 100%,120%各3份,不加樣1份),分別置50 mL量瓶中,溶解并稀釋至刻度,作為回收率供試液；另配制100%雜質混合對照溶液2份。按外標法進行回收率測定,結果均在90%～100%,見表1。

圖1 溶劑(A)、L1(B)、L1-雙胺(C)、L1-R,S(D)、L1-雙氟(E)、L1-脫氟(F)、L1及各雜質混合液(G)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of diluent(A)、L1(B)、L1-diamination(C)、L1-R,S(D)、L1-difluoration(E)、L1-defluoration (F)and mixed solution of L1 and related substances(G)

表1 回收率測定結果Tab.1 Results of recovery experiment %

2.7 有關物質檢測 取樣品約25 mg,精密稱定,于50 mL量瓶中,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,按照本法進行檢測,記錄色譜時間60 min,按外標法計算各雜質的含量,純度按面積歸一化法計,結果3批樣品中有關物質情況見表2。

3 討論

經過詳細的實驗研究,發現四氫呋喃和乙腈、甲醇對4種雜質的分離選擇性有很大差異。實驗結果表明,當流動相為水∶乙腈∶四氫呋喃∶甲醇(36∶8.4∶29∶26.6)時,主成分及4種已知雜質互相之間能獲得理想的分離效果。

表2 3批樣品檢測結果Tab.2 Determination results of three batches of samples %

本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀鈣中間體L1的有關物質檢查方法,結果表明所建立的方法準確、重復性好,可用于L1的質量控制?？刂坪弥虚g體L1的質量是確保阿托伐他汀鈣有關物質含量低和產品純度高的必要前提。本研究對于阿托伐他汀鈣原料藥生產過程的控制具有較重要的意義。

[1] 夏正君,馬堰啟,林送,等.阿托伐他汀鈣非對映異構體(3S,5R)的全合成[J].廣東化工,2012,10(39):29.

[2] 張明穎,孫國祥.HPLC法測定阿托伐他汀鈣3種中間體的含量和有關物質[J].中國藥房,2013,24(1):83.

DOI 10.3870/yydb.2014.04.026

Content Determination of Related Substances of Atorvastatin Calcium Intermediate L1 by HPLC

REN Han-cheng,ZHAO Hai-long
(Zhejiang Kinglyuan Pharmaceutical Co.,Ltd,Shangyu 312300,China)

Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for determination of the related substances of atorvastatin intermediate L1.MethodsThe chromatographic separation was performed on Agilent Poroshell EC-C18column(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)with the mobile phase consisting of H2O∶ACN∶THF∶MeOH(36∶8.4∶29∶26.6).The flow rate was 0.7 mL·min-1,the detection wavelength was 246 nm,and the column temperature was 30℃.ResultsThe method achieved good separation between L1 and its related impurites including L1-defluorination,L1-R,S,and L1-diamination.The linear range was 0.124 1-1.488 0 μg·mL-1(R2=0.999 5,n=7),0.386 6-3.093 0 μg·mL-1(R2=1,n=6),0.357 1-2.856 0 μg·mL-1(R2=0.999 0,n=6),and 0.187 3-1.498 0 μg·mL-1(R2=0.999 3,n=6)for L1-diamination,L1-defluorination,L1-R,S,and L1-difluorination,respectively.The specifications of each impurity all reached the LOQ.ConclusionL1 separates well with the impurities.The method is accurate and reliable.

Atorvastatin calcium intermediate;Chromatography,high performance liquid;Related substances

R972.6;R927.2

A

1004-0781(2014)04-0498-03

2013-08-28

2013-10-25

任漢城(1984-),男,福建長汀人,助理工程師,學士,研究方向:分析方法開發。電話:(0)15857534689,E-mail：renhancheng1314@163.com。