3-羥基丁酸衍生物對PC12細胞凋亡的保護作用*

鄒湘輝,劉博聰,2,莊東紅,查廣才,吳云影

(1.韓山師范學院生物系,潮州 521041;2.汕頭大學生物系,汕頭 515063)

3-羥基丁酸衍生物對PC12細胞凋亡的保護作用*

鄒湘輝1,劉博聰1,2,莊東紅1,查廣才1,吳云影1

(1.韓山師范學院生物系,潮州 521041;2.汕頭大學生物系,汕頭 515063)

目的 觀察3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯對PC12缺血清誘導凋亡細胞的保護作用。方法化學法降解聚羥基丁酸酯制備3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯。培養PC12細胞,以含血清培養組細胞為陰性對照組,缺血清培養組細胞為陽性對照組,以在缺血清條件下添加不同濃度3-羥基丁酸甲酯或3-羥基丁酸乙酯細胞為樣品組,通過形態學觀察法、噻唑藍(MTT)法檢測各組細胞形態及活性變化。結果與陰性對照組比較,陽性對照組細胞出現大量凋亡,形態變小變細,活性降低。樣品處理組細胞活性不同程度提高,低濃度(0.01和0.001 mg·mL-1)3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯對凋亡細胞有保護作用,濃度為1 mg·mL-1時效果最好。結論通過化學法能夠制備高純度3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯,上述兩種樣品對缺血清誘導凋亡的PC12細胞有保護作用。

3-羥基丁酸;3-羥基丁酸甲酯;3-羥基丁酸乙酯;PC12細胞;細胞凋亡

3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯是3-羥基丁酸衍生物,3-羥基丁酸是人體脂肪酸代謝后產生的3種酮體之一,通常人體血液和組織中濃度約0.1 mmol·L-1,在糖饑餓情況下可以作為腦部的一種應急性能源使用[1]。已有研究表明,3-羥基丁酸與糖尿病、體內能量代謝紊亂等有著密切聯系[2]。在以往的研究中發現,聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)在組織工程和材料學方面具有十分突出的應用潛力,目前PHA的主要應用是作為一種環境友好型生物可降解塑料。3-羥基丁酸作為高分子PHA的一種最普遍的降解產物,受到越來越多的關注[3],3-羥基丁酸和通過對聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)進行醇解衍生化生成3-羥基丁酸甲酯和-3羥基丁酸乙酯能夠促進神經膠質細胞、成骨細胞等的生長[3]。筆者前期的工作發現,3-羥基丁酸及其衍生物具有增強大鼠腦部神經遞質表達和提高大鼠認知功能的作用[4]。筆者在本實驗中采用缺血清誘導PC12細胞凋亡,研究3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯對凋亡細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備 PHB(清華大學生命科學學院微生物實驗室提供,該材料為其實驗室微生物發酵產物,純度:97.5%);達爾伯克必需基本培養液(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)高糖培養液(批號: 1154412)購自美國Gibco公司;噻唑藍(thiazole blue, MTT,批號:C18H16N5SBr)購自美國Sigma-Aldrich公司;胎牛血清購自四季青公司(批號:130620);二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自天津希恩思公司; Shimadzu氣質聯用(GasChromatograph-Mass Spectrometer,GC-MS)儀(GC-MSQP5050A);OLYMPUS 1X7/1X51倒置顯微鏡。

1.2 3-羥基丁酸甲酯及3-羥基丁酸乙酯的制備及鑒定 稱取PHB 5 g,溶于50 mL三氯甲烷,轉移至圓底燒瓶。安裝上水浴冷凝管,并放入恒溫水浴鍋,緩慢加熱攪拌溶解。另量取甲醇100 mL放入150 mL錐形瓶,同時加入濃硫酸2 mL常溫攪拌混合,將上述乙醇-濃硫酸溶液加入PHB三氯甲烷溶液圓底燒瓶,混合。溫度控制在約90℃。反應時間48 h。反應結束后,抽濾除雜。將濾液轉移至250 mL分液漏斗,加入純化水25 mL,靜置分層,收集下層有機相,加入5%碳酸氫鈉(NaHCO3)25 mL中和1次,純化水25 mL洗滌1次,分液漏斗分離,有機相用無水硫酸鈉干燥,過濾出硫酸鈉。有機相用旋轉蒸發儀蒸發三氯甲烷并干燥,減壓蒸餾得到產物。通過以上過程制備的產物用GC-MS分析其組成和比例。

3-羥基丁酸乙酯制備及鑒定與3-羥基丁酸甲酯制備方法相同,將其中的甲醇更換成乙醇。通過以上過程制備的產物用GC-MS分析其組成和比例。

1.3 PC12細胞的培養及損傷模型的建立 PC12細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液于37℃、5%二氧化碳(CO2)細胞培養箱中培養,當細胞覆蓋瓶底面積約80%時,0.25%胰蛋白酶消化離心,完全培養液重懸后進行繼代培養。取對數期生長期細胞用于分組實驗。

陰性對照組更換新鮮含5%胎牛血清的高糖DMEM培養液,陽性對照組更換新鮮不含血清的DMEM高糖培養液,3-羥基丁酸甲酯保護組更換新鮮不含胎牛血清但3-羥基丁酸甲酯終濃度為1,0.1, 0.01,0.001 mg·mL-1DMEM高糖培養液,3-羥基丁酸乙酯保護組更換新鮮不含胎牛血清但3-羥基丁酸乙酯終濃度為1,0.1,0.01,0.001 mg·mL-1DMEM高糖培養液。繼續培養24 h。

1.4 細胞形態學觀察 倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態并攝像。

1.5 MTT法檢測細胞活性 各組細胞每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL,孵育4 h后去上清液,每孔加入DMSO 150 μL,水平搖床震蕩10 min,酶標儀[芬蘭/雷勃(美國熱電),型號:Multiskan MK3]492 nm波長下測定吸光度(A)值,調零孔加入DMSO 150 μL為空白對照。

2 結果

2.1 PHB醇解產物的鑒定分析 通過醇解PHB制得3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯,經過GC-MS檢測后各產物鑒定分析結果見圖1,2和表1,2所示。

1.3-羥基丁酸乙酯;2.3-羥基丁酸乙酯圖1 PHB乙醇解產物GC-MS分析1.ethyl-3-hydroxybutyrate;2.ethyl-3-hydroxybutyrateFig.1 GC-MS analysis on ethanolysis product of PHB

表1 PHB乙醇解產物成分Tab.1 Component of ethanolysis product of PHB

1.3-羥基丁酸甲酯;2.3-羥基丁酸甲酯圖2 PHB甲醇解產物GC-MS分析1.methyl-3-hydroxybutyrate;2.methyl-3-hydroxybutyrateFig.2 GC-MS analysis on methanolysis product of PHB

表2 PHB甲醇解產物成分Tab.2 Component of methanolysis product of PHB

由表1,2可以看出,通過醇解方法對PHB進行降解可以制備高純度3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯,產物在GC-MS分析下分別有兩個不同的出峰時間。查閱數據庫后分析可知,是制備過程中同種產物出現左旋和右旋兩種不同構型形成的。

2.2 細胞形態 見圖3,4。陰性對照組細胞長勢良好,單個細胞呈現粗壯多變性,有3或4個突起,折光性高,細胞生長均勻且密度較大。陽性對照組細胞呈細絲線形或圓形欲浮起狀,兩端無法看見類似陽性對照組細胞的突起,折光性低,細胞生長不均勻且密度較小。在兩種樣品實驗組中可以看出在各個劑量下的細胞形態與陽性對照比較較粗壯,折光性恢復,無明顯細胞突起,但細胞數目明顯較模型對照組多。在3-羥基丁酸甲酯保護組中,0.01 mg·mL-13-羥基丁酸甲酯組細胞形態較陽性對照組有較大變化,細胞寬度明顯加大,少數細胞還能觀察到細胞突起存在,折光性較好。1 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯保護組細胞寬度加大,折光性好,細胞突觸數量多,細胞數目也較陽性對照組多。

2.3 細胞活性檢測 經過缺血清誘導處理后,陽性對照組細胞活性較陰性對照組差,而添加了不同劑量3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯的細胞活性均有不同程度提高,3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯在1 mg·mL-1時均呈現出最好的保護作用,劑量為0.1 mg·mL-1時保護作用不明顯,劑量為0.01和0.001 mg·mL-1時均具有一定保護作用(表3)。

3 討論

3-羥基丁酸是最普遍的PHA降解產物,近年來對于3-羥基丁酸的生理作用的研究逐漸增多,包括為大腦提供能量[3],作為腦的谷氨酸抑制性神經遞質(γ-氨基丁酸)的代謝前體物[4],和作為細胞凋亡的抑制劑作用等[5]。目前利用生物方法來進行3-羥基丁酸及其衍生物的合成很困難,且有關3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯在PC12細胞凋亡保護方面的研究還未見報道。筆者通過化學降解法成功制備得到3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯,具有很高的得率,再利用GC-MS對產物進行檢測,發現產物的純度也比較高,化學法降解PHA制備3-羥基丁酸衍生物作為一種簡單的制備手性藥物分子的途徑具有推廣利用的價值。

A.陰性對照組;B.陽性對照組;C.1 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯組;D.0.1 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯組;E.0.01 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯組;F.0.001 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯組圖4 3-羥基丁酸乙酯對缺血清誘導細胞凋亡保護作用A.negative control group;B.positive control group;C.1 mg·mL-1Ethyl-3-hydroxybutyrate group;D.0.1 mg·mL-1Ethyl-3-hydroxybutyrate group;E.0.01 mg·mL-1Ethyl-3-hydroxybutyrate group;F.0.001 mg·mL-1Ethyl-3-hydroxybutyrate groupFig.4 Protection of ethyl-3-hydroxybutyrate on the apoptosis of PC12 induced by FBS deficiency

表3 3-羥基丁酸衍生物對PC12細胞活性影響分析Tab.3 Effect of derivate of 3-hydroxybutyrate on the activity of PC12 cells ±s

表3 3-羥基丁酸衍生物對PC12細胞活性影響分析Tab.3 Effect of derivate of 3-hydroxybutyrate on the activity of PC12 cells ±s

與陽性對照組比較,*1P＜0.05Compared with positive control group,*1P＜0.05

組別吸光度值(A492nm)組別吸光度值(A492nm)陰性對照組0.176±0.008*1,χ2=4.017陰性對照組0.127±0.003*1,χ2=3.115陽性對照組0.112±0.002陽性對照組0.087±0.001 1 mg·mL-13-羥基丁酸甲酯組0.149±0.007*1,χ2=3.3231 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯組0.122±0.003*1,χ2=3.634 0.1 mg·mL-13-羥基丁酸甲酯組0.106±0.004,χ2=0.5680.1 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯組0.086±0.003,χ2=0.115 0.01 mg·mL-13-羥基丁酸甲酯組0.127±0.003*1,χ2=2.1190.01 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯組0.105±0.003*1,χ2=2.616 0.001 mg·mL-13-羥基丁酸甲酯組0.141±0.003*1,χ2=3.1350.001 mg·mL-13-羥基丁酸乙酯組0.118±0.004*1,χ2=3.213

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤克隆化的細胞株,在正常情況下PC12細胞在形態上和生理生化上與腎上腺髓質細胞相似,而在培養物中添加神經生長因子(nerve growth factor,NGF)后,PC12細胞具有神經細胞的形態和相類似的代謝產物形成[9],目前PC12細胞正被廣泛地應用于研究各種作用于神經細胞的分化、受體及神經遞質釋放等的中樞神經系統藥物的作用機制。細胞凋亡在20世紀70年代首先由HERR等[10]提出,細胞凋亡在組織和器官的發育或者多種病變過程中起著重要的作用。神經細胞凋亡是許多中樞神經系統疾病發生的最終原因,諸如老年癡呆癥、帕金森病和低氧缺血性腦損傷等,而在體外細胞培養過程中模型細胞凋亡的方式有很多種,缺血清誘導細胞凋亡是其中比較簡便且行之有效的方法之一,具體做法是去除培養液中的血清,使細胞在一定時間內處于無血清培養狀態,細胞因缺乏必要的生長因子和營養物質而發生凋亡[11]。本研究發現,PC12細胞缺血清誘導凋亡組與正常的含血清培養組比較,細胞形態變化明顯,活性降低,凋亡增加,而在添加了不同濃度3-羥基丁酸甲酯或者3-羥基丁酸乙酯的實驗組中,極低濃度的3-羥基丁酸甲酯和3-羥基丁酸乙酯都可以抑制缺血清誘導的PC12細胞凋亡,細胞數目增加,對細胞形態具有一定的修復作用,細胞活性顯著增強,高濃度組細胞的活性可達到與陰性對照組接近。推測這兩種小分子可能在低濃度時作為某一種信號分子啟動了細胞內抑制細胞凋亡基因的表達,在較高濃度時同時啟動了凋亡基因的表達而表現出對細胞的保護作用減弱,但是隨著濃度的進一步升高,可作為營養成分促進細胞的生存,詳細機制還有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.007

Protective Effect of 3-hydroxybutyrate Derivate on the Apoptosis of PC12

ZOU Xiang-hui1,LIU Bo-cong1,2,ZHUANG Dong-hong1,ZHA Guang-cai1,WU Yun-ying1
(1.Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China;2.Department of Biology,Shantou University, Shantou 515063,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of 3-hydroxybutyratederivate(methyl-3-hydroxybutyrateand ethyl-3-hydroxybutyrate)on the apoptosis of PC12 induced by FBS deficiency.MethodsMethyl-3-hydroxybutyrateand ethyl-3-hydroxybutyratewere prepared by chemical degradation.PC12 cells were divided into different groups:medium with FBS as negative control,medium without FBS as positive control,medium with different concentrations of methyl-3-hydroxybutyrateor ethyl-3-hydroxybutyratewithout FBS as sample groups.The shape and viability of cells in each group were analyzed by optical microscope and MTT.ResultsCompared with the negative control,cells in the positive control group demonstrated a large number of apoptosis,smaller and thinner morphology,and lower activity.However,the activity of cells was improved in the sample groups.Low concentration(0.01 and 0.001 mg·mL-1)of methyl-3-hydroxybutyrateand ethyl-3-hydroxybutyrateshowed a protective effect on cell apoptosis,and 1 mg·mL-1had the best protection effect.ConclusionHigh purity methyl-3-hydroxybutyrateand ethyl-3-hydroxybutyratecan be produced by chemical method,and both chemicals present good effect on protecting the PC12 from apoptosis.

3-hydroxybutyrate;Methyl-3-hydroxybutyrate;Ethyl-3-hydroxybutyrate;PC12 cell;Apoptosis

R977;R965

A

1004-0781(2014)11-1427-04

2013-09-27

2013-10-25

*廣東省自然科學基金博士啟動項目(10452104101004655);韓山師范學院青年基金項目(LQ200801)

鄒湘輝(1976-),男,湖南衡陽人,副教授,博士,主要研究方向:細胞生物學。E-mail:zxh11043@126.com。